Лекция 9 Высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ
Высокая скорость процесса (сокращение времени анализа от нескольких часов и

суток до нескольких минут)
Минимальная степень размывания хроматографических зон (появляется возможность разделять соединения, незначительно различающихся по константам сорбции)
Высокая степень механизации и автоматизации разделения, а также обработки информации (соответственно, высокий уровень воспроизводимости и точности)

изомеров.
Макромолекулы синтетических и биополимеров (включая вирусы и молекулы с массами

до нескольких миллионов).
Ионы и устойчивые радикалы.

Области использования ВЭЖХ

Биология
Биотехнология
Пищевая промышленность
Фармацевтика
Контроль загрязнений окружающей среды

фаза (ПФ) - газ
Подвижная фаза (ПФ) - жидкость

фазе
Происходят взаимодействия между анализируемыми молекулами, стационарной фазой и элюентом +

элюент может взаимодействовать со стационарной фазой

ввода пробы
Колонка
Детектор
Самописец
Устройство для регулирования Т колонки
Устройство для регулирования Т детектора

определённого объёма раствора пробы без прерывания потока элюента.
Простота в обращении.
Незначительный

клад в расширение пиков.
Воспроизводимость объёма вводимой пробы.
Возможность работы с высокими давлениями.
Возможность работы с различными объёмами проб.
Химическая инертность.

Требования к устройству ввода пробы

блоке ввода
+
простота
проба непосредственно впрыскивает в колону
объём пробы можно варьировать
-
недостаточная точность

можно было её прокачать с необходимой скоростью через хроматографическую колонку,

поскольку мелкие частицы, которыми заполнена колонка, создают высокое сопротивление потоку.

Требования к насосам высокого давления

Обеспечение с высокой точностью постоянного и равномерного потока.
Отсутствие пульсаций в дрейфе базовой линии и в шумах детектора.
Стабильность работы продолжительное время.
Простота в обращении.

падения давления в системе, скорость потока всегда поддерживается постоянной.
Периодические
Непрерывные
Фаза работы

и подачи элюента постоянно
сменяется фазой всасывания и наоборот.

+

Поток растворителя без пульсаций подаётся с постоянной скоростью

-

- После опустошения резервуар надо снова заполнять ПФ
Прокладка между поршнем и цилиндром создает проблемы при высоких давления
Не подходит для градиентного элюирования

Шприцевые насосы

Поршневые

Мембранные

Скорость потока регулируется по высоте подъёма поршня

Скорость потока регулируется по частоте

по размерам
Устойчивость к высокому давлению

полимерных материалов. Служит ёмкостью для слоя сорбента.
Фильтр: диск из

пористой нержавеющей стали.
Назначение: - удерживать слой сорбента в колонке
- задерживать механические примеси из ПФ и образцов

Наконечник: - герметизирует всю колонку
- служит для подключения капиллярных трубок, соединяющих колонку с дозатором и детектором

или же интегрируемость в систему ВЭЖХ.
Тем самым стремятся достичь полной

автоматизации хроматографического процесса т настройки параметров детектора на оптимальное детектирование каждого пика.

Требования к детекторам

через проточную кювету, заполненную веществом.
Закон Бугера – Ламберта- Бера
E

– безразмерная величина поглощения (ослабление света)

– коэффициент поглощения света

с – концентрация компонента пробы в ПФ

d - толщина слоя

свет при больших длинах волн, чем сам элюент
Нижняя граница рабочей

области для спектрофотометрических детекторов ограничена длиной волны 190 нм.

Поглощение > 190 нм наблюдается для:

соединений с двойной связью рядом с атомами, несущими неподеленную пару электронов: С=С-О-С
соединений с гетероатомами: Br, I, S
соединений с карбонильной группой: -С=О
соединений с сопряженными двойными связями: -С=С-С=С-
соединений с ароматическими кольцами

чем у чистой ПФ
Недостатки:
- Неселективный (используют в дополнение к

УФ-детекторам)
- Чувствительность в ≈ 1000 меньше, чем у УФ-детектеров

в близкой УФ и излучение которых находится в более длинноволновой

области
Чувствительность превосходит чувствительность УФ-детектора в ≈ 1000 раз при более высокой избирательности

Электрохимический детектор

Метод применим для веществ, которые можно электрохимически окислить или восстановить в соответствующих элюентах
Измерительная схема базируется на системе трёх электродов: рабочий и вспомогательный (плоские пластинки из стеклоуглерода) и электрод сравнения (второго рода)
Ограничение: недостаточная чистота элюентов и содержание в них кислорода, быстрое загрязнение рабочего электрода
Определяют: амины, аминокислоты, нитросоединения, фенолы, альдегиды

разную селективность
менее чувствительны к следам воды в подвижной фазе
Химически привитые

полярные фазы

Чем больше углеводородная часть в молекулах, тем сильней они притягиваются.
ПФ:

вода, полярные органические растворители (метанол, ацетонитрил) или их смеси.
Можно разделять широкий круг соединений, так как многие вещества растворимы в воде или подобных растворителях.
Вода не может смачивать аполярные (гидрофобные) алкильные группы и не вступает с ними во взаимодействие. Поэтому это самая слабая из всех мобильных фаз и медленнее всего элюирует пробу. Чем больше содержание воды в элюенте, тем дольше время удержания.
С ростом длины алкильных групп поверхность становится неполярной.

быть нелетучей
Из неё должно быть возможным выделение разделённых компонентов
Должна быть

инертна по отношению к материалам всех частей хроматографа, без механических примесей
Безопасная
Дешевая

Требования к ПФ

важны физические параметры ПФ: вязкость, летучесть и т.д.
Регулирование констант равновесия,

величин удерживания.
Поскольку молекулы ПФ взаимодействуют с другими компонентами системы (молекулами разделяемых веществ и НФ)

растворителей.
выполняет преимущественно транспортную функцию
служит для регулирования равновесия
Роль одного и того

же компонента в различных подвижных фазах и в зависимости от характера неподвижной фазы различна

Гексан - Хлороформ

Хлороформ - Мтенол

Растворитель типа Б

Растворитель типа А

количественную оценку адсорбционной способности растворителей в тех или иных режимах

хроматографического разделения.
Основная идея: элюенты упорядочены согласно своей полярности

Параметр полярности P’ по Снайдеру

Неполярный

Полярный

Перфторалканы

Формамид, вторичные амиды

последние не элюируются.

Сильный растворитель: ухудшится разрешение первых пиков, остальные же

компоненты нельзя будет определить

возрастающей полярности
Ступенчатое
Элюирующая сила ПФ изменяется ступенчато. Состоит в последовательном введении

в колонку с адсорбентом определённых объёмов растворителей увеличивающейся полярности.

Постепенное и непрерывное увеличение силы растворителя

Осуществляют путём непрерывного увеличения элюирующей силы растворителей по заранее заданной программе. Это достигается путём смешения двух или более растворителей в определённом соотношении с помощью специальных дозирующих устройств.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием по коэффициенту рефракции

не более 5 % об. сложных метиловых эфиров жирных кислот

(FAME) и нефтяные дистилляты диапазоном кипения от 150 °С до 400 °С.
Устанавливает метод определения массовой доли моноароматических, диароматических и три+-ароматических углеводородов высокоэффективной жидкостной хроматографией с детектированием по коэффициенту рефракции.
Массовые доли полициклических ароматических углеводородов вычисляют суммированием массовых долей отдельных групп диароматических и три+-ароматических углеводородов; общую массовую долю ароматических соединений вычисляют по сумме индивидуальных групп ароматических углеводородов.
Серосодержащие и азотсодержащие соединения могут мешать определению; моноолефины не влияют на результат определения в отличие от сопряженных ди- и полиолефинов, присутствие которых в продукте может изменить полученные результаты.

вещества не менее 99 %
Гептан, квалификации чистый для хроматографии, в

качестве подвижной фазы
1-Фенилдодекан, с массовой долей основного вещества не менее 98 %
1,2-Диметилбензол (о-ксилол), с массовой долей основного вещества не менее 98 %
Гексаметилбензол, с массовой долей основного вещества не менее 98 %
Нафталин, с массовой долей основного вещества не менее 98 %
Флуорен, с массовой долей основного вещества не менее 98 %
Фенантрен, с массовой долей основного вещества не менее 98 %
Дибензотиофен, с массовой долей основного вещества не менее 95 %
9-Метилантрацен, с массовой долей основного вещества не менее 95 %
Хризен, с массовой долей основного вещества не менее 95 %
FAME

(предназначен для задержания твёрдых частиц, возможно присутствующих в пробе)
Система колонок,

состоящая из высокоэффективной жидкостной хроматографической (ВЭЖХ) колонки (колонок) из нержавеющей стали, заполненной неподвижной кремниевой фазой с аминогруппой (или амино/циано-группой), с гранулами размером 3, 5 или 10 мкм
Устройство для регулирования температуры (нагревательный блок или система с циркуляцией воздуха, или термостат для колонки ВЭЖХ, или любую другую систему с регуляцией температуры), способное поддерживать температуру в интервале от (20 ± 1) °С до (40 ± 1) °С

коэффициента рефракции от 1.3 до 1.6





Система накопления данных (компьютер или

интегратор)
Мерные колбы вместимостью 10 и 100 см3
Весы, обеспечивающие точность взвешивания + 0.0001 г

потока жидкой фазы в пределах от 0.8 до 1.2 см3/мин

и убеждаются в том, что кювета сравнения рефрактометра заполнена подвижной фазой.
2. Готовят стандартный раствор 1 (СКС 1) для калибровки. Для этого в мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают с точностью ±0.0001 г:

(1.0 ±0.1) г циклогексана
(0.1 ±0.01) г 1-фенилдодекана
(0.5 ± 0.05) г 1,2-диметилбензола
(0.1 ± 0.01) г гексаметилбензола
(0.1 + 0.01) г нафталина
(0.05 ± 0.005) г дибензотиофена
(0.05 ± 0.005) г 9-метилантрацена

3. Помещают колбу с ее содержимым в ультрафиолетовую ванну и выдерживают до тех пор, пока визуально не станет видно, что все компоненты растворились в смеси 1,2-диметилбензола/ циклогексана.
4. Удаляют колбу с раствором из ультрафиолетовой ванны и доводят до метки гептаном.

(СКС 2). Для этого в мерную колбу вместимостью 100 см3

помещают с точностью ±0.0001 г:

(0.4 ±0.1) г FAME
(0.04 ±0.01) г хризена

6. Раствор в колбе доводят до метки гептаном.
7. Выдерживают раствор в ультразвуковой ванне при температуре 35 °С до тех пор, пока визуально раствор не будет гомогенным, без отложений хризена на дне.
8. Инжектируют 10 мкл СКС 1.

9. Убеждаются в том, что все компоненты СКС 1 элюируют в следующем порядке: циклогексан, фенилдодекан, 1,2-диметилбензол, гексаметилбензол, нафталин, дибензотиофен и 9-метилантрацен.
10. Вводят 10 мкл СКС 2 и проверяют, как элюирует пик хризена — перед первым пиком FAME или вместе с ним. Обеспечивают, чтобы пик, соответствующий времени удерживания хризена, был выше, чем пик, соответствующий времени удерживания 9-метилантрацена.

С и D с приблизительной (но точно известной) концентрацией (указана

в таблице), для чего в мерные колбы с точностью 0.0001 г взвешивают соответствующие соединения и доводят до метки гептаном.

2. Вводят 10 мкл калибровочного раствора А. Записывают хроматограмму и измеряют площадь пика для каждого ароматического соединения калибровочного раствора.
3. Те же процедуры повторяют для остальных калибровочных растворов.
4. Строят график зависимости рассчитанной площади от концентрации (г/100 см3) для каждого ароматического соединения в растворе.

см3 взвешивают от 0.9 до 1.1 г образца с точностью

0.001 г и доводят гептаном до метки. Энергично встряхивают колбу для перемешивания. Дают раствору постоять в течение 10 мин и, если необходимо, используют фильтр для удаления нерастворимых веществ.
2. Когда условия проведения испытания станут стабильными и идентичными условиям калибровки, инжектируют 10 мкл раствора образца и начинают сбор данных.

3. Проводят идентификацию пиков, соответствующих МАУ, ДАУ и Т+-АУ.

Т+-АУ в процентах по массе определяют как:
площадь пика МАУ, ДАУ

или Т +- АУ образца

тангенс угла наклона калибровочной прямой МАУ, ДАУ или Т +- АУ (концентрация в г/100 см3 в зависимости от площади пика);

начальная ордината калибровочной прямой для МАУ, ДАУ или Т+-АУ

объем раствора образца, см3

масса отобранного образца, г

2. Рассчитывают содержание полициклических ароматических углеводородов образца в процентах по массе путем сложения диароматических и три+-ароматических углеводородов (т.е ДАУ и Т+-АУ) и общее содержание ароматических углеводородов в пробе в процентах по массе путем сложения процентов по массе различных групп ароматических углеводородов (т.е. МАУ, ДАУ или Т+-АУ).