Слайд 1Медицинские приборы и системы для лабораторного анализа
Курс «Медицинские приборы и
системы»
Лекция 6
Слайд 23.3.4. Эмиссионная фотометрия
Спектры испускания, или эмиссионные, получают при возбуждении атомов
различными способами (тепловыми столкновениями, фотонами, электронным ударом и т.д.). Время
жизни возбужденного состояния невелико и составляет 10-7-10-8 с. В течение этого времени атом теряет избыточную энергию путем испускания кванта электромагнитного излучения.
Слайд 3Люминометрия и флуориметрия
Излучение света молекулами – люминесценция - может происходить
при передаче энергии им в различных процессах:
- воздействие потоком электронов
(катодными лучами) – катодолюминесценция;
- тепловой нагрев – термолюминесценция;
- химические реакции – хемилюминесценция;
- воздействие электрическим током – электролюминесценция;
- ультразвуковое воздействие – сонолюминесценция;
- воздействие механическим трением – триболюминесценция;
- облучение ионизирующей радиацией – радиолюминесценция;
- облучение ультрафиолетовым и видимым светом – фотолюминесценция или флуоресценция.
Слайд 4В основе явления люминесценции лежат процессы поглощения энергии с последующим
излучением фотонов.
Схема энергетических уровней внутримолекулярных переходов:
1 - абсорбция; 2 -
флуоресценция; 3 - фосфоресценция;
а - излучательные переходы; б - безызлучательные переходы.
hf = Ei – Ek, λ = c/f
Слайд 5Флуоресценция получило свое название от природного минерала – флюорита CaF2
Веществами,
способными к свечению – флуорофорами – являются такие биологические соединения
как триптофан, тирозин, фенилаланин, нуклеотиды (НАДН, НАДФ-Н), флавины, порфирины, хлорофиллы, каротиноиды, некоторые витамины, окисленные липиды, белки и другие.
В качестве меток при проведении флуофесцентного и люминисцентного анализа часто используются флуорофоры и люминофоры:
Слайд 6Схемы наблюдения флуоресценции
1 – ртутная лампа;
2 – светофильтр;
3 – кювета
с раствором исследуемого вещества;
4 – приемник излучения.
а – приемник принимает
только флуоресцентное излучение.
б – применяется только для сильно флуоресцирующих растворов
В качестве источника излучения обычно используются ртутные дуговые лампы с линейчатым спектром с максимумами на 365, 405, 436 и 546 нм.
Приемники - обычно фотоумножители.
Слайд 7Фотопоток флуоресценции, испускаемый во всех направлениях (при малых концентрациях, когда
наблюдается равномерное свечение образца)
ФФ = Ф0(1 – Т)nи/nп = Ф0(1 – 10–СL)nи/nп,
где nи и nп – число излученных
и число поглощенных квантов. При малых значениях концентрации:
ФФ = Ф0ln(10)СLnи/nп = KC,
где К = Ф0ln(10)Lnи/nп – постоянный коэффициент.
Слайд 8Схема устройства флуорометра
Схема устройства анализатора поляризации флуоресценции
1 – источник,
2,
4 – монохроматоры
(светофильтры),
3 – кювета,
5 – детектор,
6 – измерительный прибор
1 – источник,
2, 5 – монохроматоры (светофильтры),
3, 6 – поляризатор и анализатор, 4 - кювета,
5 – детектор,
6 – измерительный прибор
Слайд 9Поляризация флюоресценции используется для определения лекарств, наркотиков и других малых
молекул иммунохимическим методом.
Флюоресценция с разрешением во времени - возбуждение
флюоресценции короткими импульсами света, и измерение ее через некоторое время, когда возбуждающий импульс уже угас.
В качестве флюорофоров используются лантаниды – редкоземельные элементы : самарий (Sm), европий (Eu), тербий (Tb) и др. Для них сдвиг Стокса - сотни нанометров, время флюоресценции - сотни микросекунд.
Измеряя флюоресценцию на разных длинах волн и через разные промежутки времени после освещения импульсом возбуждающего света, можно одновременно количественно определять несколько флюорофоров этой группы. Это позволяет использовать двойные метки – например, одновременно пометить и измерять концентрации и антигена и антитела, что значительно повышает точность определения.
Слайд 10Преимущества флуориметрии:
флюоресцентные и люминесцентные технологии увеличивают линейный диапазон до 6-8
десятичных порядков, то есть позволяют работать без разведения;
более высокая чувствительность,
которая может на четыре порядка превышать чувствительность фотометрических методов;
очень высокая специфичность определения (лишь небольшое число веществ обладает способностью к флуоресценции), кроме того, вещества, имеющие сходные спектры возбуждения, могут иметь различные спектры испускания и наоборот;
возможность флуориметрического определения пикограммовых количеств анализируемых веществ;
Недостаток: зависимость результатов измерений от температуры и рН в образце
Слайд 13анализатор флуориметрический FL 2110 (Беларусь)
анализатор ФЛУОРАТ-02 (Россия)
WALLAC 1420 MULTILABEL
COUNTER (VICTOR-2) (Финляндия)
Слайд 14Пламенная эмиссионная фотометрия
Широко используется для измерения лития (Li), натрия (Na)
и калия (К), кальция (Са) в жидкостях организма, может применяться
для измерения более 60 элементов.
1 – проба; 2 – капилляр; 3 – распылитель; 4 – распыляющее сопло; 5 и 6 – стабилизаторы расхода воздуха и горючего газа; 7 – сопло горючего газа; 8 – горелка;
9 – сферическое зеркало; 10 – пламя;
11 – оптический узел; 12 – светофильтры или монохроматор; 13 – фотоприемник;
14 –усилитель; 15 – устройство обработки и отображения информации
Слайд 15В пламенном фотометре исследуемое вещество (в виде водного солевого раствора)
при помощи газа-носителя диспергируется в воздухе.
В идеальных условиях имеется линейная
взаимосвязь между концентрацией атомом элемента Са в дисперсии и интенсивностью света на определенной для данного элемента длине волны (b = 1):
Для измерения различных элементов используются светофильтры на следующие длины волн: Li – 671 нм,
Na – 589 нм, K – 768 нм.
Пламенная эмиссионная фотометрия основана на проведении сравнительных измерений, поэтому калибровочные пробы должны приготавливаться и анализироваться одновременно с исследуемыми образцами
Слайд 16 Энергию возбуждения пламени можно менять в широких пределах
соответствующим подбором состава горючего газа и газа-носителя
Слайд 17Пламенную фотометрию используют для определения ионов калия и натрия в
сыворотке крови, моче, эритроцитах, спинно-мозговой жидкости, экссудатах, транссудатах, в желудочном
соке, иногда измеряют содержание кальция и лития. Для одновременного определения натрия и калия достаточно правильно приготовить комплексный калибровочный раствор, который одновременно содержит и калий, и натрий в концентрациях, близких тем, которые бывают в исследуемом материале. Нельзя только забывать, что в плазме крови соотношение концентраций этих элементов другое, чем в моче, поэтом калибровочный раствор для мочи не подходит для анализа крови, и наоборот.
Определение электролитов методом пламенной фотометрии характеризуется высокой надежностью, чувствительностью, простотой и быстротой выполнения (в течение нескольких минут) и считается референтным методом для определения натрия и калия. Однако опасность работы с горючими и взрывоопасными газами и системами все чаще приводит к замене этих приборов микроанализаторами ионов с селективными электродами.
Слайд 18 - предназначен для измерения концентрации ионов щелочных и щелочно-земельных
металлов (натрий, калий, литий, кальций) в растворах путем измерения интенсивности
их эмиссионных линий при распылении анализируемого раствора в пламени газовой горелки;
- применяется в медицине, энергетике, сельском хозяйстве, на предприятиях водоснабжения, в химической, стекольной, металлургической и других отраслях промышленности.
Фотометр пламенный ПФА-378 четырехканальный
(Новолаб, Новосибирск)
Слайд 20 - предназначен для определения концентрации ионов щелочных (Na,
K, Li) и щелочноземельных (Ca, Ba) металлов в жидких средах
в лабораторных условиях;
- используется в сельском хозяйстве, сырьевых отраслях промышленности, в химической и металлургической промышленности, на предприятиях водоснабжения, в медицине.
Пламенный фотометр PFP-7 (Jenway, Англия)
Основные особенности:
- высокое разрешение - до 1 ppm (1 ppm = 1 г/т = 1 мг/кг);
- специальные стеклянные фильтры с узким диапазоном пропускания
длины волны для подавления помех (установлены на диске, что
обеспечивает быструю смену фильтров);
- встроенная система электронного поджига и пропуска пламени;
- независимые регуляторы усиления и точки нуля;
- результаты измерений отображаются на легко читаемом
светодиодном индикаторе.
Слайд 23 3.4. Рефрактометры
Действие рефрактометров основано на явлении полного
внутреннего отражения при прохождении светом границы раздела двух сред с
разными показателями преломления.
Сущность метода:
известен показатель преломления измерительной призмы N, нужно определить показатель преломления n испытуемого образца.
Слайд 26Типа Аббе Типа Пульфриха
Методы:
метод скользящего
луча
метод полного внутреннего отражения
Слайд 27Принцип действия рефрактометра Аббе
призменный блок Аббе
- призма Амичи
Слайд 28I – эталонная призма
II – вспомогательная призма
4 – градусный лимб
6
– компенсатор окраски
Рефрактометр ИРФ-22
1 – корпус
2 – измерительная
головка
3 – зрительная
труба
5 – зеркало
7,8 – маховички
Слайд 29Принцип действия рефрактометра Пульфриха
1 – источник света
2 – конденсорная
система
3 – измерительная
призма
4 – зрительная труба
5
– углоизмерительная
система
6 – испытуемый образец
Положения трубы
I II
Слайд 30Рефрактометр ИРФ-23
1 – штатив
2 – градусный лимб
3 – автоколлимационная труба 4 – отсчетный микроскоп
5 – лампа подсветки
6 – измерительная призма
7 – диафрагма объектива
8 – микрометрический винт
10 – конденсор
11 – натриевая лампа
12 – блок питания лампы
13 - термометр
Слайд 31Сравнение технических характеристик рефрактометров Пульфриха и Аббе