Мутации и механизмы репарации ДНК

дисциплине «Генетика микроорганизмов»

бактерий.
Молекулярные механизмы возникновения мутаций. Механизм действия мутагенов (УФ, радиация,

аналоги оснований, алкилирующие агенты, азотистая кислота, акридиновые красители и т.д.). Мутации, возникающие в процессе репликации ДНК. Гены - мутаторы. Индуцированный мутагенез.
Классификация мутаций. Мутации морфологические, устойчивости к ингибиторам, чувствительности к мутагенным факторам, ауксотрофные, условно летальные. Обратные мутации.
Понятие о мутационных системах и мутационном анализе. Методы выделения мутантов.

Механизмы репарации ДНК. Репарационные системы.
Световая репарация. Эксцизионная репарация. Репарация неспаренных оснований. Пострепликативная репарация. Толерантная репарация. SOS - ответ.
Механизм работы продуктов гена uvr (UvrA,B,C,D). Коррекция неспаренных оснований с участием продуктов генов mutH, mutS и mutL.
Другие ферменты, участвующие в репарации: N-гликозидазы, апуриновая эндонуклеаза, ферменты рекомбинационного комплекса, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза и пр.

План лекции:

внешней средой во всех или только нескольких клетках популяции, представляют

собой прямое приспособление (адаптацию) к действию внешней среды.
Другие приписывали главную роль длительным модификациям — это возникающие под действием внешней среды адаптивные изменения, которые, не влияя на наследственные свойства организма, существуют в течение многих поколений уже после того, как вызвавший их фактор внешней среды перестал действовать.
Третьи рассматривали изменения бактерий как регулярно повторяющиеся жизненные циклы – т.е. как правильную последовательность «фаз культуры», где проявление каждой стадии зависит от условий среды.
Лишь очень немногие исследователи того времени признавали, что бактериальная изменчивость может заключаться в появлении спонтанных и ненаправленных изменений (мутаций) в одной или нескольких клетках, в дальнейшем подвергающихся отбору.

Эволюция взглядов на изменчивость микроорганизмов

изменять генетическую информацию. Такие изменения первичной структуры DNA не исправленные

репарирующей системой, называются мутациями.
Причинами мутаций могут быть: повреждение DNA ультрафиолетом, ионизирующей радиацией, химическими соединениями окружающей среды и, кроме того, ошибки репликации.
Генетические мутации ведут к синтезу измененного, дефектного белка. Мутации, затрагивающие регуляторную зону оперона, приводят к нарушению регуляции или прекращению синтеза белка.

Мутации

реплик (отпечатков)
Доказательство мутационной природы изменчивости

используются 5-бромурацил и 2-аминопурин). Некоторые аналоги настолько сходны с нормальными

пиримидиновыми и пуриновыми основаниями, что поглощаются клетками и включаются в ДНК, где в значительной степени выполняют функцию нормальных оснований, но в отличие от них обнаруживают большую тенденцию связывать «ложного» партнера при репликации ДНК.
Бромурацил по структуре аналогичен тимину, поэтому включается вместо него в цепь ДНК как партнер аденина. При репликации цепи, содержащей БУ, он в енольной форме спаривается как цитозин, т.е вызывает включение гуанина вместо аденина.

Механизмы возникновения мутаций. Мутагены

одного пиримидина другим пиримидином.

Если пурин будет замещен пиримидином, или

наоборот, такие замены называют трансверсиями.

Химическое изменение оснований:
Некоторые мутагенные вещества (этилметансульфонат, гидроксиламин, азотистая кислота) — вызывают химическую модификацию ДНК, большей частью специфичную в отношении определенных оснований, изменяя их способность к спариванию с другими основаниями, что приводит к ошибкам репликации, такие мутагены влияют на точность репликации.
Алкилирующие агенты:
Этил- и метилметансульфонат,
диметил- и диэтилсульфат, этиленимин,
зотистый или серный иприт,
а также N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин
Этилметансульфонат этилирует преимущественно атом N-гуанина. Образовавшийся 7-алкилгуанин отщепляется от цепи, в результате чего в ней образуется «пропуск». При очередной репликации на этом месте часто оказывается «ошибочное» основание.

Механизмы возникновения мутаций. Мутагены

могут оказывать полициклические ароматические соединения - профлавин и другие акридиновые

красители. Например, молекула акридина внедряется между соседними основаниями цепи ДНК и увеличивает расстояние между ними (интеркаляция). Мутация со «сдвигом рамки»:

Механизмы возникновения мутаций. Мутагены

другие виды ионизирующего излучения оказывают на микроорганизмы как подавляющее жизнедеятельность

(летальное), так и мутагенное воздействие (действуют в основном на нуклеиновые кислоты). При длине волны 260нм повреждаются пиримидиновые основания. Например, два соседних тиминовых основания в ДНК могут оказаться ковалентно связанными. Наличие таких димеров тимина служит затем источником ошибок при репликации.

Мутации, вызываемые транспозонами.
Транспозоны - это короткие двойные цепи ДНК, которые состоят из более чем 2000 пар оснований и обычно обусловливают устойчивость к одному антибиотику.

Транспозоны способны «перепрыгивать» из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно; таким образом, они могут включаться в различные участки генома. В случае внедрения транспозона в какой-либо структурный ген хромосомы нуклеотидная последовательность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид. Возникнет инсерционный мутант.

Механизмы возникновения мутаций. Мутагены

сшивки ДНК-белок
двунитиевые и однонитиевые разрывы спирали ДНК
двунитиевые разрывы
однонитиевый разрыв
Т-Т

сшивка

дезаминирование цитозина

Механизмы возникновения мутаций

крайне редко с частотой 1-100 на миллион экземпляров данного гена.

В популяции бактерий без всякого экспериментального вмешательства и в отсутствие каких-либо явных внешних факторов, ускоряющих мутагенез, регулярно возникают мутации.
Спонтанный мутационный процесс зависит как от внутренних, так и от внешних факторов, которые называют мутационным давлением среды.

ошибки репликации (некомплементарные пары нуклеотидов — мисмэтчи)
апуринизация (отщепление азотистых оснований от сахаро-фосфатного остова – образование АР-сайтов)
дезаминирование (отщепление аминогруппы от азотистого основания).

Классификация мутаций

Спонтанные мутации

на одну генерацию называют частотой мутирования.

Численная доля мутантов в

клеточной популяции для разных признаков различна и варьирует в пределах от 10 -4 до 10-11.
При высоких скоростях роста она постоянна, и ее обычно определяют для клеток в экспоненциальной фазе роста при оптимальных условиях среды.

Классификация мутаций

соседних пиримидиновых оснований)
размыкание пуринового кольца
однонитевые и двунитевые разрывы в ДНК
сшивки

между цепями ДНК

Мутагены же бывают трех видов:
Физические ( радиация, электро-магнитное излучение, давл, темп. и др.),
Химические (цитостатики, спирты,фенолы и т.д.),
Биологические ( бактерии и вирусы ).

Классификация мутаций

классификация связана с оценкой жизнеспособности образовавшегося мутанта.
Классификация мутаций
3. По

изменению генотипа

Мутации бывают
генные (изменение молекулярной структуры генов, возникающие в результате замен, вставок или выпадения нуклеотидов),
хромосомные (структурные изменения хромосом, возникающие вследствие перемещения или выпадения значительных по протяженности частей хромосом) и
геномные (изменение числа хромосом).

нуклеотида всегда приводит к изменению аминокислоты, третий же обычно не

приводит к замене белка. К примеру, "Молчащая мутация"- изменение нуклеотидной последовательности, которая приводит к образованию схожего кодона, в результате аминокислотная последовательность белка не меняется.
Замена нуклеотида в кодоне может привести к изменению смысла кодона — миссенс мутации, и появлению в белке новой аминокислоты. Если в результате замены нуклеотида кодон превращается в терминирующий — нонсенс мутации, то синтезируется незавершенный белок, так как его синтез прерывается на этом кодоне.
Транзиция - состоит в замене одного пурина другим пурином или одного пиримидина другим пиримидином.
Если пурин будет замещен пиримидином, или наоборот, такие замены называют трансверсиями.
Транслокации - перенос фрагмента ДНК в новое положение, например в результате интеграции плазмиды в различные участки хромосомы хозяина или обмена гомологичными последовательностями нуклеотидов между плазмидой и хромосомой либо между двумя хромосомами после удвоения ДНК и деления клетки.
Инверсии - изменение порядка нуклеотидов в ДНК на обратный по отношению к ориентации в штаммах дикого типа, возникающее обычно в результате рекомбинации с переворотом.

Классификация мутаций

Генные мутации

ДНК и синтезируют новую последовательность ДНК, замещающую их. Место повреждения

распознает эндонуклеаза, расщепляющая цепь ДНК вблизи дефекта, фрагмент удаляется, а дефект восполняется при помощи ДНК-полимеразы, которая проникает в брешь и встраивает в нее отсутствующие нуклеотиды, используя неповрежденную цепь ДНК в качестве матрицы. ДНК-лигаза ковалентно связывает 3' -конец вновь синтезированного участка ДНК с цепочкой.
Ошибки при полимеризации ДНК возникают с частотой 10-5, корректорная активность ДНК-полимеразы снижает эту частоту до 10-10 в рассчете на нуклеотид.

Мутации, возникающие при репликации

Ошибки репликации

Гены-мутаторы

К генам-мутаторам относятся многие гены системы репликации, репарации и рекомбинации ДНК, увеличивая спонтанную мутабельность в сотни раз.

в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной,

так и химической природы.

К повреждающим событиям могут быть отнесены следующие:
1) введение одноцепочечных разрывов;
2) удаление основания, в результате чего его гомолог остается неспаренным;
3) превращение одного основания в другое, которое неправильно спарено с основанием-партнером;
введение ковалентных связей между основаниями на одной цепи ДНК или между основаниями на противоположных цепях.

Репарация

репарация
осуществляющая вырезание поврежденных нуклеотидов (NER - nucleotide excision repair)

или азотистых оснований (BER - base excision repair)
репарация неспаренных оснований
пострепликативная
SOS-репарация

Виды репарации

которая служит для ликвидации возникающих нарушений (PHR photoreactivation).
•

Защитное действие заключается в восстановлении биологической активности клеток или молекул ДНК, поврежденных ультрафиолетовым излучением в результате последующего воздействия видимого света.
• Фотореактивация под действием видимого света была обнаружена в 1949 г. нескольких лабораториях, механизм же этого явления был раскрыт в начале 60-х годов нашего века после выделения К. Рупертом из клеток микроорганизмов фермента фотореактивации -дезоксирибопиримидинфотолиазы.
• ДНК-фотолиаза представляет собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300-600 нм, для этого в их структуре имеется особый светочувствительный центр. Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота), участвующих в фотохимической активации фермента. ДНК­фотолиаза E.coli представляет собой белок с молекулярной массой 35 кДа, прочно связанный с олигорибонуклеотидом длиной 10-15 нуклеотидов, необходимым для активности фермента.

Фотореактивация

содержащей поримидиновый димер.
Образование комплекса фотолиаза-ДНК. Комплекс сохраняется до момента освещения

видимым светом.
3. Поглощение фотона. Разрыв ковалентных связей между пиримидиновыми кольцами

Фотореактивация

удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной

структуры молекулы. Данный процесс осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют дорепликативной.

• Реакции, протекающие во время репарации были открыты 1964 г. группами Р. Бойса, П. Говарда-Флендepca, Р. Сетлоу и У. Кэрриера.
В эксцизионной репарации обычно участвуют несколько ферментов, а сам процесс затрагивает не только поврежденные, но и соседние с ним нуклеотиды. Кроме этого, для эксцизионной репарации необходима вторая (комплеметарная) цепь ДНК.

• Различают: эксцизионную репарацию оснований (BER) и нуклеотидную эксцизионную репарацию (NER).

Эксцизионная репарация

оснований. Его катализируют ДНК-N-гликозилазы - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между

дезоксирибозой и азотистым основанием.
● В результате действия ДНК-N-гликозилазы образуется апуриновый/апиримидиновый сайт (АР-сайт), который взаимодействует с ферментом AP-эндонуклеазой. Она разрывает сахарофосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем caмым создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы, которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК.
• Образовавшаяся брешь застраивается соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы, ориентирующейся на вторую цепь ДНК.
• Окончательное сшивание репариванных участков осуществляется ДНК-лигазой.

Экзонуклеаза

Эксцизионная репарация оснований

набором дефектов, удаляемых этим механизмом: тиминовые димеры, фотопродукты, аддукты взаимодействия

псоралена с тимином, и др.
• Универсальность NER достигается благодаря большому количеству белков, участвующих в процессах узнавания дефекта и присоединения к нему. Репаративный комплекс NER включает в себя, по крайней мере, 16 полипептидов.
• Данный процесс осуществляется с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и др.).
• У Е. coli нуклеаза состоит из 3-х различных протомеров - uvr А, uvr В и uvr С, каждый из которых и выполняют определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК.
Протомер uvr А - обладает АТФазной активностью, связывается с ДНК в виде димера, осуществляя первичное распознавание повреждения и связывание uvr В.
Протомер uvr В - обладает латентной АТР-азной и латентной хеликазной активностью, он же обладает эндонуклеазной активностью, расщепляя межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь со стороны З'-конца выщепляемого фрагмента.
Протомер uvr С - действует как нуклеаза, вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5'-конца вырезаемого фрагмента.

Нуклеотидная эксцизионная репарация

и вырезает поврежденный участок.
2. Вырезанный фрагмент удаляется и разрушается

экзонуклеазами. Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у различных групп прокариот.
3. ДНК-полимераза заполняет брешь комплементарными нуклеотидами, а ДНК-лигаза зашивает оставшиеся разрывы

Эндонуклеаза

Нуклеотидная эксцизионная репарация

репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на

10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды - мисмэтчи (от англ. mismatch). Такие ошибки корректируются с помощью мисмэтч-системы репарации.

● У E.coli в процесс инициации репарации вовлечены продукты четырех генов: mut S, mut L, mut Н и mut U. Как было выяснено позже, mut U есть не что иное, как ген uvr D, кодирующий геликазу II.

● Клетки используют важное различие в структуре матричной и дочерней нитей, найденное в 70-х. Оказалось, что вскоре после окончания репликации специальные ферменты - метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательностях GATC.

Репарация неспаренных оснований

с неправильным основанием
G
g
- N – метилированный аденин
Mut S
Mut H
Mut L
Mut

S

Репарация неспаренных оснований

контролем белков Rec A происходит рекомбинация участок комплементарной цепи сестринской

нити (черная) переносится в район бреши.

3. Брешь в сестринской ДНК застраивается в ходе репликативного синтеза (застроенный участок показан светло-серым цветом); концы новой и старой нитей соединяются ДНК-лигазой.

1

2

3

Пострепликативная репарация

Радманом в 1974 г., ему же принадлежит название этому механизму,

включающее в него международный сигнал бедствия «SOS». Данный механизм занимает особое место среди клеточных репарирующих систем, ее еще называют "ошибочной" репарацией. У бактерии Е. coli ферменты этой системы синтезируются только в ответ на действие на клетку ДНК-повреждающих агентов, например УФ-излучения

• Основная задача такой системы - модифицировать ДНК-полимеразу и поврежденный участок ДНК таким образом, чтобы не блокировалось действие ДНК-полимеразы.

• Наиболее изучена SОS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами Rес А и Lех А. Первый из них представляет собой полифункциональный белок Rec А, участвующий в рекомбинации ДНК, a второй (белок Lex А) является репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДИК бактерий.

SOS-репарация