Нанобиотехнологии в изучении молекулярных основ патогенеза, диагностики и

центральной нервной системы

нейроспецифическим белкам
Наночастицы в диагностике и векторной терапии заболеваний ЦНС
4.1. Липосомальные

наноконтейнеры
4.2. Полимерные наноконтейнеры
4.3. Магнитные наночастицы
4.4. Мицеллярные наноконтейнеры
4.5. Порфириновые аддукты фуллерена С60
Заключение

веков, несомненно, стала нейроиммунохимия.

Нейроиммунохимия – научная дисциплина, изучающая нейроспецифические антигены

и антитела к ним.

Именно этому классу биологически активных молекул, характеризующихся высокой специфичностью для клеток нервной ткани, отводится значительная роль в биохимии и молекулярной биологии специфических интегративных процессов нервной системы (память, мышление, внимание, эмоции).

нейроспецифических белков подтвердило концепцию, согласно которой специфические свойства любой ткани

определяются паттерном экспрессируемых в ней кодирующих генов.
Экспрессия генов этих белков значительно снижена или полностью заблокирована почти во всех клетках, за исключением нервной ткани.
Из наиболее изученных на сегодняшний день нейроспецифических белков стоит отметить:
белки семейства S100,
триплет нейрофиламентов (NF-68, -160, -200),
нейроспецифическую енолазу (NSE),
глиофибриллярный кислый белок (GFAP),
основной белок миелина (MBP) и α2-гликопротеин мозга (α2GP)

запоминания:
Антитела к S100 препятствуют развитию долговременной потенциации гиппокампа, при которой

происходит выброс свободного антигена S100 из глиальных клеток в интерстициальное пространство
S100 участвует в облегчении проникновения Ca2+ внутрь клетки и в мобилизации цитоплазматического пула Ca2+ в нейронах и глиальных клетках
Гиперэкспрессия антигена S100 приводила к достоверному снижению эффективности обучения трансгенных мышей с множественными копиями гена этого белка
Доказано участие S100 в модулировании сборки цитоскелета глиальных клеток:
S100 связывается с мономерами неполимеризованного GFAP и тем самым ингибирует его полимеризацию

нейрофиламентов, специфичный для нейронов, и GFAP, специфичный для астроглии, широко

применяются для иммунофенотипирования клеток нейроэпителиального происхождения в первичных и линеаризованных культурах из нервной ткани:
Триплет нейрофиламентов незаменим для идентификации нейронов, в частности для доказательства дифференцировки стволовых и прогениторных клеток по нейрональному пути
GFAP применяется для идентификации дефинитивных и реактивных астроцитов. С помощью иммунофлуоресцентной визуализации этого белка, в частности, можно легко дифференцировать незрелый астробласт от зрелого реактивного астроцита.

имеет два важных последствия:
Эти белки почти полностью отсутствуют в периферическом

кровотоке и могут появляться там только при патологии центральной нервной системы (ЦНС) и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).
Т.к. ГЭБ в норме полностью отграничивает мозг от клеток иммунной системы, у последних отсутствует иммунологическая толерантность к нейроспецифическим белкам. Вследствие этого элиминация нейроспецифических белков в кровоток потенциально может запускать иммунный ответ и продукцию нейротоксических аутоантител.

диагностическими маркерами поражения нервной ткани, но и патогенетическим звеном в

механизме аутосенсибилизации в процессе развития заболеваний ЦНС.

Анализ уровня некоторых нейроспецифических белков (NSE, S100b, MBP, GFAP и др.) в сыворотке крови позволяет охарактеризовать как степень патологических изменений в ЦНС, так и прогнозировать исход различных критических состояний нейропсихического генеза.
Например, иммуно-ферментный анализ GFAP позволяет оценить степень астроглиоза и воспалительных изменений в головном мозге.
Кроме того, концентрация GFAP в сыворотке крови находится в прямой зависимости от объема реактивного астроглиоза, и, следовательно, прямо пропорциональна размеру очага дифференцированной опухоли мозга

пока незаменимый инструмент как для детекции антигена-мишени в сложном белковом

растворе, так и для адресной (направленной) доставки чего-либо в клетку, презентирующую антиген-мишень.
Моноклональные антитела (МА) к нейроспецифическим белкам – один из основных биотехнологических инструментов в нейробиологии. С учетом высокоселективной экспрессии нейроспецифических антигенов, МА к ним являются весьма перспективными векторными молекулами для транспорта диагностических и лекарственных препаратов через ГЭБ.
Концепция направленного транспорта в мозг с помощью антител тесно связана с преодолением ГЭБ.
МА, пригодные для это цели, должны специфически распознавать антиген-мишень и не терять иммунохимическую активность in vivo.
Для создания направленности МА антиген-мишень должен присутствовать в патологическом очаге в мозге в концентрации, намного превышающей его уровень в нормальных тканях, и при этом быть доступным для антител, циркулирующих в кровотоке.

накопление моноклональных антител к GFAP в мозге крыс с поврежденным

ГЭБ в результате окклюзии средней мозговой артерии. Эти данные показали возможность применения данных антител для направленного транспорта лекарственных препаратов в патологические очаги, в частности, при экспериментальной глиоме С6 (Чехонин В.П. и соавт., 2004).
Факторами, которые могут обеспечить адресную доставку с помощью моноклональных антител к GFAP являются:
избыточная экспрессия антигена-мишени астроцитами в перитуморальной зоне
критическое повышение проницаемости ГЭБ в неопластических микрососудах
В экспериментах in vivo было показано более чем 20-ти кратное накопление моноклональных антител к GFAP в опухоли, по сравнению с интактной тканью

(Cx43) – основной структурный компонент щелевых контактов между астроцитами, участвующими

в функциях ГЭБ.
Экспериментальные данные показали активирующее влияние Cx43 на процессы инвазии мультиформной глиобластомы человека и ее аналога у крыс – экспериментальной глиомы С6 (Oliveira R., 2005).
В экспериментах in vivo удалось детектировать моноклональные антитела к экстраклеточному домену Е2 Cx43 в опухоли С6 спустя 48ч после внутривенного введения. Антитела накапливались в коннексин-положительных клетках астроглиаль-ного вала (Баклаушев В.П., 2009).
Как показали исследования, далеко не все клетки, захватывающие Mab к Cx43 из кровотока являются GFAP-позитивными. Этот феномен может говорить о преимущественном накоплении моноклональных антител к экстраклеточному фрагменту Cx43 в дедифференцированных астроцитах перитуморальной зоны – астробластах (Баклаушев В.П., 2010).

к GFAP и Cx43 имеет несколько очевидных перспектив:
Крайне важно, например,

при хирургической резекции опухоли правильно определить ее границы с учетом всех имеющихся участков перивазальной и периневральной инвазии. Поскольку реактивные астроциты сопровождают все такие участки, их визуализация позволит четко отграничить область инвазии глиомы от нормальной ткани.
В последних исследованиях показано, что именно в перитуморальной области идет наиболее активная инвазия глиомы. В этой области локализуются так называемые стволовые опухолевые клетки, поддерживающие пул активно мигрирующих радио- и химиорезистентных клеток глиомы.
Таким образом, с помощью МА к GFAP и Cx43 можно пытаться доставить в эти клетки перитуморальной зоны мощные цитостатики или терапевтические гены.

препаратов существенно ограничена двумя фундаментальными проблемами:
преодоление ГЭБ
проблема селективности действующего агента

по отношению к клеткам-мишеням в ЦНС
Нанотехнологические подходы позволяют создавать многофункциональные высокоселективные наносистемы, способные доставлять транспортируемый агент сначала в церебральные микрососуды, а затем в интерстициальную жидкость и непосредственно к клеткам-мишеням в головном мозге.
Такие препараты и системы способны действовать на субклеточном уровне, близком к молекулярному, но при этом они сохраняют преимущества макросистем (в частности, высокий уровень загрузки транспортной конструкции активными агентами)

связанные с полимерными наночастицами или заключенные в наноконтейнеры, образованные полимерами

или низкомолекулярными соединениями.
Наносистемы позволяют:
повысить растворимость и стабильность активных агентов
обеспечить адресную доставку активных агентов к органам и клеткам-мишеням
Таким образом, сформировались такие области медицины как наномедицина, нанофармакология и нанофармация.

в водной среде образуют систему жировых пузырьков, ограниченных внешней бислойной

липидной мембраной и содержащих в своем внутреннем пространстве некоторый объем водной фазы, захваченной при механическом эмульгировании.
Липосомы являются наиболее разработанными контейнерами для доставки лекарственных препаратов и генетического материала через гематоэнцефалический барьер.

Липосомы (от нескольких нм до нескольких мкм) - это везикулярные структуры, состоящие из униламеллярных или мультиламеллярных липидных бислоев, окружающих внутренние водные компартменты.

лекарственным средством как гидрофильной, так и гидрофобной природы.
Загружаемые полярные

или гидрофильные вещества будут находиться преимущественно во внутренней водной фазе липосом.
Липофильные или амфифильные вещества внедряются в липидную мембрану.
Заключение в липосомы значительно продлевает среднее время пребывания лекарственного средства в кровотоке, уменьшает выраженность его побочных эффектов и повышает терапевтическую эффективность.

которая может быть построена из амфи-фильных липидов, имею-щих в своих

молекулах как гидрофобные, так и гидро-фильные группировки.

Для построения искусственных липосом наиболее часто используются различные лецитины (фосфатидилхолины), фосфатидилсерины и фосфатидилэтаноламины. В состав липосом обычно вводят и холестерин, амфифильность которому придает гидроксильная группа, присоединенная к гидрофобной молекуле этого стероидного компонента практически всех естественных биологических мембран.

полимерами, образующим экранирующую «щетину» из цепочек полимера длиной 10-20 нм.

Чаще всего в этом качестве используется полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой около 2000 Да.
Такие ПЭГилированные липосомы становятся «невидимками» (stealth-liposomes) для ретикулоэндотелиальной системы млекопитающих:
они в гораздо меньшей степени, чем неПЭГилированные липосомы, подвергаются опсонизации;
они хуже распознаются макрофагами печени и селезенки и поэтому дольше циркулируют в кровотоке (период полувыведения составляет 15 и более часов).

Dil-ПЭГилированные иммунолипосо-мы с антителами к MBP в течение трёх (А)

и шести (В) часов.
С, D — Неспецифические иммунолипосомы
(Chekhonin V.P., 2007)

Иммунолипосомы – липосомы, конъюгированные с антителами
Факт связывания ПЭГилированных иммунолипосом (с моноклональ-ными антителами к MBP) с клетками определялся по появлению специ-фического красного свечения, обус-ловленного липидным флуорес-центным индикатором Dil, введен-ным в состав липосомных мембран.
При инкубации с живыми культура-ми шванновских клеток наблюда-лось окрашивание клеточных струк-тур, содержащих белок-мишень век-торных моноклональных антител

система направленного транспорта, включающей биотини-лированные антитела к экстраклеточному фрагменту Е2

Cx43 и липосомы со стрептавидином, содержащие красную флуоресцентную метку Dil С18 (Баклаушев В.П., 2009)

A: Эксперимент показал специфи-ческую флюоресценцию Dil в препа-ратах глиомных клеток после-довательно инкубированных с биоти-нилированными антителами к Е2 Сх43 и липосомами со стрептави-дином и флюоресцентной меткой.

B: Прединкубация клеток с избыт-ком небиотинилированных антител к Сх43 почти полностью блокировала появление флюоресценции после добавления биотинилированных антител и липосом со стрепта-видином.

была выбрана из нескольких соображений.
Во-первых, константа диссоциации комплекса стрептавидин-биотин

(10-15 М) почти в два раза ниже, средней константы диссоциации комплекса антиген-антитело (не менее 10-9 М), вследствие чего применение первого комплекса должно повысить специфичность накопления транспортируемых липосомальных контейнеров.
Во-вторых, в случае применения бинарной системы, конъюгация стрептавидина с липосомой приводит к образованию существенно меньшего комплекса, чем при конъюгации с липосомой антител (молекулярная масса стрептавидина почти в три раза меньше молекулярной массы иммуноглобулинов G).
Система может применяться для направленного транспорта диагностических и терапевтических агентов к Сх43-положительным клеткам глиомы in vivo.

выступали уже описанные выше моноклональные антитела к GFAP и экстраклеточному

фрагменту коннексина-43.
Флуоресцентный анализ срезов мозга после внутривенного введения иммунолипосом крысам с экспериментальной глиомой выявил их накопление в области перитуморального астроглиального вала.
Точно так же и на МРТ-снимках было обнаружено накопление T1-сигнала в перитуморальной области, в месте максимальной экспрессии антигенов-мишеней.
Таким образом, удалось создать систему адресной доставки в перитуморальную зону, работающую в системе in vivo.

полимеров размером от 10 до 1000 нм.
Полимерные наноконтейнеры обладают рядом

преимуществ:
Малый размер полимерных наночастиц позволяет им преодолевать различные биологические барьеры, в том числе и ГЭБ
Полимерные наночастицы могут обеспечить высокую плотность терапевтических молекул, которые могут быть инкапсулированы, диспергированы или растворены в данных наночастицах.
Широкие возможности выбора полимера и механизма высвобождения лекарственного средства из полимерных наночастиц делают их уникальными кандидатами для доставки лекарств.
Наиболее часто используемыми нанополимерами являются биологически инертные полимеры полиэтиленгликоль, поли-L-глутаминовая кислота, поли(алкилцианоакрилат) и поли(бутил)цианоакрилат.

деградации дофаминергических нейронов в черной субстанции.
Считается, что заболевание Паркинсона включает

в себя апоптоз нейронов, тогда как NGF (фактор роста нервов) предотвращает этот процесс, как было показано во многих исследованиях.
Полимерные наночастицы полибутилцианоакрилата, покрытые оболочкой из полисорбата-80, способны адсорбировать на своей поверхности NGF и доставлять его в мозг, преодолевая ГЭБ.
В исследованиях на мышах (Kurakhmaeva K. A., 2009) было показано, что внутривенное введение наночастиц с NGF позволило побороть амнезию и улучшить память экспериментальных животных. Полученная наносистема продемонстрировала значительное угасание симптомов заболевания Паркинсона, таких как олигокинезия, мышечная ригидность и тремор.

β-амилоидных пептидов, также называемых сенильными бляшками.
Тиофлавин-Т позволяет детектировать сенильные бляшки,

однако, лишен способности преодолевать ГЭБ.
Латексные наночастицы, содержащие тиофлавин-Т, стереотаксически вводились мышам в гиппокамп. Микроскопическое исследование срезов мозга показало преимущественное накопление наночастиц в микроглии и нейронах.
Таким образом, с помощью латексных наночастиц с тиофлавином-Т можно визуализировать внутриклеточное образо-вание β-амилоидных пептидов и их отложение во внеклеточном пространстве.

магнитный момент.
Особенно широкое применение получили магнитные наночастицы оксидов железа (магнетита

Fe3O4 или маггемит Fe2O3), покрытые биосовместимой оболочкой из полисахаридов, белков, синтетических полимеров или мономеров.
Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа с диаметром менее 30 нм представляют собой важнейший новый класс МРТ-контрастных агентов для визуализации патологий головного мозга.
При воздействии внешнего магнитного поля такие наночастицы более эффективно повышают контраст МРТ-снимков по сравнению с агентами на основе хелатов гадолиния, используемых в клинической практике.

декстраном и конъюгированные с человечес-ким эпидермальным фактором роста (EGF) позволили

эффек-тивно визуализировать глиому С6 у крыс (Shevtsov M.A., 2014).
Использование EGF позволило преодолеть ГЭБ и обеспечить адресную доставку нанодиагнос-тикума непосредственно в пато-логический очаг за счет специ-фического взаимодействия с рецепторами опухолевых клеток.

Control

SPION

SPION-EGF
(24 ч)

SPION-EGF
(48 ч)

является создание наночастиц, которые сочетают в себе свойства оптических нанозондов

и возможностей традиционной диагностики, например, МРТ.
Так, были разработаны (Lee J-H., 2006) наночастицы с кремниевым ядром, содержащим флуоресцентную метку и окруженным магнитными наночастицами
Для обеспечения адресной доставки наночастиц, их конъюгировали с антителами HmenB1, специфически взаимодействующими с полисиаловыми кислотами, которые экспрессируют клетки нейробластомы
Таким образом, разработан контрастный агент для специфического высокоэффективного выявления клеток нейробластомы с помощью одновременной оптической и МРТ-визуализации

Двойной контрастный агент

Визуализация (оптическая/МРТ) клеток нейробластомы

образованные молекулами, состоящими из гидрофобной и гидрофильных частей, которые в

водных растворах самопроизвольно образуют агрегаты (мицеллы), которые имеют гидрофобные и центральные участки и гидрофильные внешние оболочки.
Мицеллярные наноконтейнеры в настоящее время достаточно широко применяются для разработки адресных препаратов, способных преодолевать гистогематические барьеры.
Некоторые из них, в частности, цитостатические препараты в составе мицеллярных контейнерных лекарственных форм на основе плюроников успешно прошли клинические испытания и применяются в комбинированной противоопухолевой терапии.

из средней гидрофобной части (поли-пропиленгликоль) и концевых гид-рофильных фрагментов (полиэти-ленгликоль).
Для

придания наноконтейне-рам биологической специфичности в мицеллообразующий полимер добавлялось определенное коли-чество плюроника, конъюгирован-ного с векторными МА к GFAP.
Полная наноконтейнерная сис-тема образуется после солюбили-зации препарата галоперидола в растворе таких мицелл.

При использовании такой системы доставки галоперидола наблюдался эффект практически 100-кратного увеличения токсичности по сравнению с аналогичными значениями для простой солюбилизации этого нейролептика в мицеллах плюроника.

новый лекарственный препарат РМС16 - является моно-аддуктом железосодержащего порфирина с

классическим бакминстерфуллереном – бакмин-стерфуллерен(C60)-2-(бутадиен-1-ил)-тетра-(o-γ-аминобутирил-o-фталил)-ферропорфирином

Создан новый класс медицинских углеродных катионообменных наночастиц (нанокатионитов), представленных порфириновыми аддуктами фуллерена-С60

Препарат представляет собой
низкотоксичные;
амфифильные;
способные к образованию кластеров мембранотропные наночастицы размером 1,8 нм.

названного «спин-селективная биохимия», основы которого были заложены в Институте химической

физики им. Н.Н. Семёнова академиком РАН А.Л. Бучаченко в результате обнаружения магнитных изотопных эффектов в биологических системах.

В частности, было впервые показано, что магнитный изотоп магния 25Mg, в отличие от наиболее распространенного немагнитного изотопа 24Mg, является специфическим гиперактиватором большинства Mg2+-зависимых реакций синтеза АТФ в клетке. Примечательно, что гиперактивация энергетического метаболизма ионами 25Mg2+ требует незначительного количества этих ионов и имеет место даже при отсутствии кислорода (глубокая тканевая гипоксия и ишемия).

патогенетическими механизмами в развитии двух наиболее значимых в медико-социальном отношении

заболеваний: инфаркта миокарда и ишемического инсульта.
Таким образом, актуальность создания адресного индуктора синтеза АТФ в условиях гипоксии — огромна.
Причины тканевой гипоксии весьма разнообразны: это и врожденные нарушения метаболизма (синдром Ледерера-Вальдека), и отравления (СО, нитрофенолы), и избыточные физические нагрузки, и ингаляторное кислородное голодание, и побочные эффекты лекарств — ингибиторов окислительного фосфорилирования.

подавлением окислительного фосфорилирования АДФ в митохондриях клеток. Это значит, что

запасной путь регенерации АТФ, а именно фосфорилирование АДФ, катализируемое ферментами семейства киназ, может быть выбран для фармакологического воздействия с целью уменьшения или даже исключения побочного эффекта доксорубицина во время (или до) длительной цитостатической терапии.
И субстратный, и окислительный пути фосфорилирования являются Mg2+-зависимыми процессами и поэтому могут быть ускорены вплоть до 2,5 раз ультрамикроколичествами 25Mg2+.
Простое «эндоосмотическое давление» вызывает замещение одного изотопа Mg другим (25Mg, также как 24Mg, и 26Mg стабильные изотопы) в активном сайте креатинкиназы, наиболее эффективном участнике резервного синтеза АТФ, что приводит к значительной интенсификации образования АТФ в очаге гипоксии.

фармакологическим требованиям:
ее структура позволяет осуществлять так называемое «умное высвобождение» магния

in vivo, то есть высвобождение магния в ответ на тканевой ацидоз, вызванный гипоксией.
порфириновый домен PMC16 определяет тканевую и субклеточную селективность в результате взаимодействия с порфириновыми рецепторами, локализованными на мембранах митохондрий кардиомиоцитов, лимфобластов и нейронов.
Благодаря способности обеспечивать адресную доставку катионов парамагнитного изотопа 25Mg к местам локализации ткане-специфических митохондриальных порфирин-связывающих белков, РМС16 является первым и пока единственным фармакологическим агентом, позволяющим избирательно использовать магнитный изотопный эффект 25Mg для гиперактивации синтеза нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ) в страдающих от гипоксии миокардиоцитах, нейронах, лимфоцитах и лимфобластах.

быстрому прогрессу в области высокоспецифичной доставки в мозг лекарственных препаратов,

а также визуализации и диагностики мозга.
Направленная доставка препаратов, вероятно, является основным исследовательским направлением в наномедицине ЦНС. Наличие более специфичных и эффективных мишеней должно способствовать развитию более безопасных и эффективных ЦНС-направленных нанолекарств.