Слайд 2История открытия первых вирусов
1.Вирус табачной мозаики -
Д.И.Ивановский – 1892
г.
2.Бактериофаг - д’Эррель – 1917 г.
3. Прион - Стэнли Прузинер
– 1982 г.
Слайд 3Основные отличия вирусов от других форм жизни
один тип нуклеиновой кислоты
отсутствие
клеточного
строения,
белоксинтезирующих систем,
энерго-запасающих систем
возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с
ним репликации
разобщённый (дизъюнктивный) способ размножения (репликации)
Слайд 4Основные признаки, используемые для классификации вирусов
тип нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК),
структура генома
– количество нитей (цепочек) НК,
целостность или фрагментированность генома,
наличие суперкапсида,
наличие обратной
транскриптазы (для отнесения к семейству ретровирусов).
Слайд 5Иерархическая система таксонов, применяемых в вирусологии
Царство: Vira
Подцарства: ДНК-геномные
вирусы
РНК-геномные вирусы
Семейство
Название таксона заканчивается на –viridae
Подсемейство
Название таксона заканчивается на –virinae (существует у некоторых семейств)
Род - основной таксон в классификации вирусов.
Название таксона заканчивается на –virus.
Вирус
Серовары
По антигенной структуре
Слайд 6Формы существования вирусов
внеклеточная = вирион (структура) :
НК
капсид
[суперкапсид]
Н-р, вирион имеет
форму…
внутриклеточной – вирус: размножение,
заболевания:
- НК
Н-р, вирус размножается…..
Вирус гриппа….
Слайд 7Принцип строения вириона
Простоустроенный:
НК+ капсид = нуклеокапсид
Сложноустроенный: нуклеокапсид + суперкапсид
Слайд 8Типы симметрии капсида
спиральная
кубическая
Слайд 9Принцип строения суперкапсида
билипидный слой
матричный белок
гликопротеины (шипы, ворсинки)
Слайд 10Общая характеристика ДНК вирионов
форма:
линейная
кольцевая
на концах – идентичные повторы:
маркеры вирусной (не
клеточной) ДНК
способны замыкать ДНК в кольцо
репликация
транскрипция
устойчивость к клеточным эндонуклеазам
интеграция в
клеточный геном
Слайд 11Общая характеристика РНК вирусов
форма:
линейная
кольцевая
структура:
цельная
фрагментированная
информационная функция:
+нить (позитивный геном) = иРНК
-нить (негативный
геном) ≠ иРНК
Слайд 12Общая характеристика белков вирусов
Структурные
капсидные
«внутренние», гистоноподобные (НК рибо/дезоксирибонуклеопротеин)
Функциональные (ферменты)
Вирионные,
Вирусиндуцированные,
вирус может
модифицировать клеточные ферменты.
Слайд 13Этапы размножения вирусов в чувствительной клетке
прикрепление,
проникновение и депротеинизация,
синтез компонентов вируса:
ранних
и поздних белков,
множественная репликация генома,
сборка вирионов,
выход вирионов из клетки.
Слайд 15Способы культивирования вирусов
куриный эмбрион
культура клеток
организм лабораторного животного
обнаружение наличия вируса
(индикация)
определение типа
вируса
(идентификация)
Слайд 16Использование для вирусологического метода куриного эмбриона
5-7-дневные, реже – 10-11-дневные
Слайд 17Основные способы заражения куриных эмбрионов
на хорион-аллантоисную оболочку,
в хорион-аллантоисную полость,
в полость
желточного мешка,
в полость амниона,
в тело эмбриона.
Слайд 18Обнаружение вирусов в курином эмбрионе
Индикация:
гибель эмбриона,
морфологические изменения эмбриона в целом
или оболочек,
РГА с жидкостью из полостей куриного эмбриона.
Идентификация:
РН (в т.ч.
РТГА)
РСК
Слайд 19Использование культур клеток
Культуры клеток = соматические или эмбриональные клетки человека
или животных, культивируемые в лабораторных условиях.
Подразделяют по числу жизнеспособных генераций
на:
- первичные,
- перевиваемые,
- полуперевиваемые.
Слайд 20Первичные культуры клеток
получают из тканей (эмбриональных или нормальных) многоклеточных организмов.
В основе получения лежит обработка протеолитическими ферментами (трипсином) = первично-трипсинизированные.
Н-р, эмбриональная ткань человека, почечная ткань эмбрионов человека и обезьян.
Такие клетки не способны к делению – их используются однократно.
Слайд 21Перевиваемые культуры клеток
= стабильные = готовят из опухолевых клеток, способных
длительно размножаться in vitro не меняя своих свойств.
Н-р,HeLa –
выделены из карциномы шейки матки,
Hep-2 – из карциномы гортани,
Hep-3 – лимфокарцинома,
KB – эпидермоидная карцинома полости рта,
Детройт-6 – костный мозг больного раком легкого.
Слайд 22 Преимущества перевиваемых культур клеток перед первичными:
продолжительность культивирования – десятки
лет,
высокая скорость размножения,
меньшая трудоемкость,
сохраняют свои свойства в замороженном состоянии много
лет,
возможность использования международных линий культур.
Но: злокачественный характер и возможность мутаций ограничивает применение для производства вакцин.
Слайд 23Полуперевиваемые культуры клеток
= диплоидные клетки различных тканей и органов, способные
к ограниченному размножению in vitro,
они сохраняют свои свойства в
течение 20-50 пассажей (пересевов) = до года,
при культивировании не претерпевают злокачественного перерождения – преимущество перед перевиваемыми → могут использоваться в производстве вакцин.
Слайд 24
Условия культивирования клеток:
Питательные среды сложного состава (среда 199, Игла), сод-т
источники энергии (глюкозу), минеральные вещества, аминокислоты, витамины, сыворотку крови, факторы
роста.
Клетки чувствительны к изменениям рН – для контроля рН добавляют индикатор и буферные растворы.
Соблюдение правил асептики.
Использование лабораторной посуды из нейтрального стекла – пробирки, флаконы, матрасы (=флакон 4-х гранной формы).
Добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста бактерий.
Соблюдение оптимальной температуры культивирования (36-38,5о).
Слайд 25 Обнаружение = индикация вирусов в культуре клеток
проводят на основе
следующих феноменов:
- цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов или
цитопатического эффекта (ЦПЭ),
- образования внутриклеточных включений,
- образования “бляшек”,
- реакции гемагглютинации, гемадсорбции или “цветной” реакции.
Слайд 26
ЦПД - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до
их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов
Культура
клеток
ЦПД вируса
Слайд 27Виды ЦПД
- округление и сморщивание клеток – пикорнавирусы,
- нарастающая деструкция
– герпесвирусы,
- пролиферация (образование дырок) – поксвирусы,
-образование гигантских многоядерных клеток
= симпласты – парамиксовирусы.
Слайд 28Включения
= скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или
ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании.
Н-р,
вирус бешенства в цитоплазме образует тельца Бабеша-Негри,
вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.
Слайд 30Бляшки, или “негативные” колонии
— ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых
на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна
на фоне окрашенных живых клеток.
Один вирион образует потомство в виде одной бляшки.
“Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации.
Слайд 31Реакция гемагглютинации (РГА)
основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание)
эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.
Слайд 32
Реакция гемадсорбции =РГАдс = способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать
на своей поверхности эритроциты.
Слайд 33Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Слайд 34Использование лабораторных животных
взрослые или новорожденные белые мыши, хомяки, кролики, обезьяны
применяется
для выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре клеток
или курином эмбрионе,
Вид и способ заражения – от вируса
индикация:
заболевание животного
его гибель
идентификация:
РН
Слайд 35Способы заражения лабораторных животных
интраназально,
подкожно,
внутримышечно,
внутрибрюшинно,
интрацеребрально,
Слайд 36Обнаружение вируса при заражении лабораторных животных
обнаруживают вирус по:
- развитию
видимых клинических проявлений – параличи – рабдовирусы,
-патоморфологическим изменениям органов
и тканей – пикорна-, тогавирусы
- в реакции гемагглютинации с суспензией из органов,
недостаток:
- высокая вероятность контаминации организма животных посторонними микробами,
- необходимость заражения культуры клеток для выделения чистой культуры вируса.
Слайд 37Прионы
– белковые молекулы, способные вызывать разрушение клеток организма человека
и животных.
Они характеризуются устойчивостью:
к высоким температурам,
ионизирующей радиации,
ультрафиолету.
Слайд 38Прионы
Прионный белок – изоформная молекула,
может существовать в двух
формах:
нормальная клеточная форма(РrPc),
инфекционная форма (PrPs)
Слайд 39Нормальная клеточная форма(РrPc)
обнаруживается в организме всех млекопитающих.
Ген, кодирующий
этот белок, расположен в коротком плече 20 хромосомы.
РrPc участвует
в передаче нервных импульсов, в поддержании циркадных ритмов клетки,
Слайд 40Инфекционная форма (PrPs)
характеризуется:
измененной вторичной и третичной структурой молекулы,
и
высокой устойчивостью к нагреванию, ультрафиолетовому свету, проникающей радиации и переваривающему
действию протеаз.
Слайд 42БАКТЕРИОФАГ
= вирус, поражающий прокариотическую клетку,
Структура:
НК (ДНК или РНК),
белок
Слайд 44Строение классического бактериофага
Слайд 45Морфологические типы бактериофагов
I тип (нитчатые)
без головки (только отросток)
II тип
без отростка
(только головка)
III тип
головка и отросток, короткий без чехла
IV тип
головка и
отросток, длинный с чехлом, не сокращающийся
V тип
головка и отросток, длинный с чехлом, сокращающийся
Слайд 47Классификация фагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку
Вирулентный,
Умеренный.
Слайд 48Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой
адсорбция фага на специальных рецепторах
КС
(на протопластах не происходит)
проникновение НК
(депротеинизация)
репликация фаговой НК и синтез
фаговых белков
сборка фаговых частиц
выход зрелых фагов
лизис бактерии бактерия не погибает
(«взрыв») (некоторые нитчатые фаги)
ПРОДУКТИВНАЯ ИНФЕКЦИЯ
Слайд 49Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой
адсорбция фага на специальных рецепторах
КС
(на протопластах не происходит)
проникновение НК
(депротеинизация)
интеграция фаговой НК в геном
бактерии
профаг
(фаговый репрессор блокирует транскрипцию)
лизогенная культура
Л И З О Г Е Н И З А Ц И Я
в дальнейшем – может быть индукция профага
продуктивная инфекция
Слайд 50Практическое применение бактериофагов
1.Фагодиагностика,
2. Фаготерапия,
3. Фагопрофилактика.
Слайд 51Фагодиагностика
Выявление определённого вида бактерий в патологическом материале
реакция нарастания титра фага
Идентификация
чистой культуры
определение вида
фагоиндикация
определение фаговара
фаготипирование
Слайд 52Практическое применение бактериофагов
● Фаготерапия
Фаг применяется местно.
●Фагопрофилактика
брюшной тиф,
Дизентерия.
Слайд 53Выделение бактериофага
Материал:
объект внешней среды
бактериальная культура
бактериальный фильтр
фильтрат
МПБ + чувствительная бактерия
инкубация
роста нет
– фаг присутствует (очищают фильтрованием)
рост есть – фаг отсутствует
Слайд 54Метод фагоиндикации «стекающая капля»
стекающая капля по газону засеянной культуры
регистрация роста
бактерий в месте стекания капли
рост есть – -
роста нет –
+
Слайд 56Титрование фага по Грациа
МПА + разведение фагосодержащего материала + чувствительная
культура
МПА (подложка)
чашка Петри со средой (в разрезе)
Слайд 58Фаготипирование бактерий
засев газоном на пластинчатый агар изучаемого штамма
нанесение капель типовых
фагов
инкубация
регистрация «стерильных пятен» («бляшек»)
фаготип (фаговар) = перечень типовых фагов, лизирующих
данный вариант