Особенности молекулярно-генетической и морфологической идентификации грибов

н.с. ФГБНУ ВНИИСХМ
Крюков Алексей Анатольевич
rainniar@rambler.ru
2018
1ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной

микробиологии», Санкт-Петербург, Россия;

2ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»,
Санкт-Петербург, Россия

Юрков А.П.1,2, Крюков А.А.1, Горбунова А.О.1,2

et al., 1998) с ред. Юркова А.П.

Исследование посвящено изучению грибов

арбускулярной микоризы (АМ) подотдела Glomeromycotina, образующих один из самых распространенных в природе симбиозов с высшими растениями (92% семейств)

в ткани растения-хозяина, являются арбускулы. АМ гриб при этом получает

от растения продукты фотосинтеза. Растение взамен получает фосфор – один из важнейших элементов для питания растений

Схема трансмембранного транспорта в арбускулярной микоризе (M. Hahn et al., 2001) с изм. и доп. Юркова А.П.

качества
жизни
Получение экологически чистых продуктов
Решение продовольственной проблемы
Применение препаратов грибов арбускулярной

микоризы

г. действует географическая сеть опытов (ГСО)
Культуры, для которых показана достоверная

симбиотическая эффективность АМ-инокулята в рамках полевой ГСО*

Проект “Оценка видового состава и экологической

значимости арбускулярных микоризных грибов
естественных и агроэкосистем
Европейской территории России”
РФФИ №15-29-02753 офи_м (рук. Юрков А.П.)

Ключевые задачи:
выделить и идентифицировать изоляты АМ-грибов до вида или рода из естественных экосистем и агроэкосистем, встречающихся в отдельных регионах ЕТР;
оценить их симбиотический потенциал (симбиотическую эффективность), интенсивность роста в условиях различного обеспечения доступного фосфора в почве.

Mycorrhizal Fungi (INVAM), США http://invam.wvu.edu/the-fungi/classification

Banque Europeenne des Glomeromycota (BEG),

Франция http://www.i-beg.eu

Centre for Mycorrhizal Culture Collection (CMCC), Индия http://mycorrhizae.org.in/cmcc/prod_res.php

The Glomeromycetes in vitro Collection, Canada (GINCO-Can), Канада http://www.agr.gc.ca/eng/science-and-innovation/research-centres/ontario/eastern-cereal-and-oilseed-research-centre/the-glomeromycetes-in-vitro-collection/?id=1236786816381

Swiss Collection of Arbuscular Mycorrhizal Fungi (SAF), Швейцария http://www.agroscope.admin.ch/grandes-cultures-systemes-pastoraux/05911/06653/index.html?lang=en

.. И мы тоже создаем коллекцию (на данный момент более 150 изолятов, которые требуют идентификации)

растению-хозяину;
высокий генетический полиморфизм грибов АМ, включая полиморфизм на внутривидовом уровне

(в т. ч. участок SSU–ITS1–5.8SrRNA–ITS2–LSU);
трудность разграничения “популяция” и “особь” для Glomeromycotina;
наличие криптических видов, не различимых по морфологическим признакам

Glomus
Ambispora, Claroideoglomus, Corymbiglomus, Diversispora, Dominikia, Entrophospora, Funneliformis, Kamienskia, Pacispora, Paraglomus, Redeckera, Rhizophagus, Sclerocystis, Septoglomus

fungi and their value for ecosystem management // Biodiversity –

The Dynamic Balance of the Planet. Ed. O. Grillo. IntechOpen. 2014. P. 159-192

Таксономия
отдела Glomeromycota

Schüßler A. Glomeromycota species list.
Last updated May 1, 2018.
http://www.amf-phylogeny.com/
amphylo_species.html

В 2016 г. данный отдел преобразован в подотдел Glomeromycotina
отдела Mucoromycota
От 120 до 360 видов

(фото по центру и справа).
Цвет спор в воде: от бесцветных

(гиалиновых) и лимонно-кремовых до белых. Внекорневые спорокарпы представляют собой небольшие скопления спор без слизистого материала, количество спор – около 100, образовались из внутрикорневых спорокарпов (числом спор более 1000), формируемых в омертвевших корнях плектрантуса южного (Plectranthus australis). Прозрачность спор в воде: прозрачные.
Также фиксируются еще 21 параметр: форма и размеры внекорневых и внутрикорневых спор, цвет, толщина и структура слоев оболочки спор в реактиве Мельцера, цвет, толщина и форма несущих гиф, а также толщина их каналов и наличие септы, видовые особенности у спор, например, изогнутость слоя L3 у места прикрепления, форма и размеры образуемых внутрикорневых структур – арбускул, везикул, мицелия и спор.

Пример морфологической идентификации АМ-гриба

Внекорневой спорокарп шт. 30 в воде (на фото слева – спорокарп, образован из омертвевшего корня; на фото по центру – фрагмент внекорневого спорокарпа; на фото справа – фрагмент внутрикорневого спорокарпа)

По результатам морфологической оценки спор, гиф и симбиотических структур штамм №30 отнесен к виду Rhizophagus diaphanus (ранее называемый Glomus diaphanum Morton & Walker, 1984; Schenk, Perez, 1988).

30 из 65 выделенных штаммов АМ грибов
Видовая принадлежность, координаты отбора

30 штаммов АМ-грибов, определенных по морфологическим признакам спор и спорокарпов

признакам спор и спорокарпов (продолжение)

микоризе (M и m),
обилие арбускул (A и a) и везикул

(B и b) в корне и в микоризе.
“?” - видовое название уточняется.

Зеленые ячейки со значениями достоверно не отличающимися от максимального (P<0.05),

серые - достоверно не отличающимися от минимального (P<0.05).

Активность развития изолятов АМ-грибов в корнях плектрантуса южного по данным показателей микоризации на 90 сут от посадки (ранжирование по виду)

показателей микоризации на 90 сут от посадки (ранжирование по виду)

Встречаемость микоризной инфекции (F), интенсивность микоризации в корне и в микоризе (M и m),
обилие арбускул (A и a) и везикул (B и b) в корне и в микоризе.
“?” - видовое название уточняется.

Зеленые ячейки со значениями достоверно не отличающимися от максимального (P<0.05),

серые - достоверно не отличающимися от минимального (P<0.05).

MlS-1
Medicago lupulina L.
70-е сут
от посадки
Cамоопылитель,
диплоид (2n=16),
размер генома ~500

Мб,
высокая cеменная продуктивность
до 2500 семян с растения,
короткий ЖЦ (однолетник)

Исходная линия MlS-1 Medicago lupulina L. var. vulgaris Koch, выращенная на почве с низким уровнем Рд с инокуляцией (+АМ) и без инокуляции (–АМ) грибом Rhizophagus irregularis штаммом 8
(= шт. RCAM00320)
(Юрков, Якоби, 2011)

–АМ

+АМ

происхождения
Жирным шрифтом выделены существенные по t-критерию на 5%-ном уровне значимости

значения коэффициентов корреляции. “Вид” – порядковый номер вида АМ-гриба (виды пронумерованы в порядке возрастания по алфавиту, способ ранжирования при этом не влияет на итоговую корреляцию), “Экотоп” – порядковый номер экотопа, из которого был выделен изолят АМ-гриба (номер экотопа рассчитан по возрастанию степени антропогенной нагрузки: 1 – лес, 2 – лесополоса, 3 – естественный луг, 4 – залежь, 5 – пашня.). “F” – встречаемость АМ в корнях P. australis R.Br.; “FбезР” и “F+Р” – встречаемость АМ в корнях M. lupulina L. при низком (“безР”) и среднем (“+Р”) уровне Рд в почве, соответственно; “ЭhбезР”, “Эh+Р”, “ЭwбезР” и “Эw+Р” – эффективность АМ, рассчитанная по средней высоте (h – “height”) и сухому весу (w – “weight”) надземных частей растений M. lupulina при низком и среднем уровне Рд в почве, соответственно.

Выводы:
1) Наиболее существенным параметром, определяющим формирование эффективной АМ на растениях, является F - встречаемость АМ в корнях накопительной культуры.
2) При среднем уровне Рд в почве (7мг Р2О5 /100 г почвы) все показатели корреляции снижаются относительно варианта с низким уровнем Рд в почве.
3) В условиях низкого Рд в почве неэффективными штаммами были 8 из 25 проанализированных штаммов, относящиеся к родам Glomus и Funneliformis, в условиях среднего Рд – Glomus и Sclerocystis, т.е. штаммы рода Funneliformis переходят в группу эффективных. Все грибы родов Rhizophagus и Paraglomus были эффективными на обоих фонах Рд.

в пробе, а также наличием ДНК растения-хозяина.
Решение: Применение колонок Dynabeads

позволит выделять ДНК из одной споры.
Дополнительный раунд вложенной ПЦР предотвратит контаминацию.

Krüger, M., Stockinger H., Krüger C., Schüßler A. DNA-based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal fungi. // New Phytology. 2009. V. 183. P. 212-223.

Результат идентификации из микоризованных корней плектрантуса южного – накопительной культуры АМ-грибов

Крюков А.А., Юрков А.П. Оптимизация процедуры молекулярно-генетической идентификации грибов арбускулярной микоризы в симбиотическую фазу на примере двух близкородственных штаммов. // Микология и фитопатология. 2018. Т. 52. № 1. С. 38-48.

лет использовались несколько участков ядерного и митохондриального геномов.

участки из

кластера генов 35S рРНК генома ядра (участки генов 18S и 26/28S рДНК, районы ITS1 и ITS2, 5.8S рДНК),

ген LSU митохондриальной рРНК,

гены RPB1 и RPB2 субъединиц I и II РНК полимеразы II,

ген PTG — фосфатный транспортер,

ген H+ АТФазы,

ген β-тубулина,

а также генов, кодирующих фактор элонгации 1-альфа (EF 1-α).

Известна и попытка использовать в качестве ДНК-штрихкода АМ-грибов ген COX1 (митохондриальный ген, кодирующий субъединицу I цитохром с-оксидазы)

АМ-грибов. С использованием универсальных грибных праймеров NS31 с AM1 М.

Опик с соавт. провели анализ 179279 последовательностей, из которых 77,5% принадлежали к 47 таксонам АМ-грибов, выделенных из корней 10 видов растений.

В этой же работе было показано, что методом 454 выявляется в 1,5 больше таксонов грибов, чем при секвенировании по Сэнгеру.
Это подтвердило неэффективность метода клонирования-секвенирования при идентификации АМ-грибов.

Opik M, Metsis M, Daniell TJ, et al. Large-scale parallel 454 sequencing reveals host ecological group specificity of arbuscular mycorrhizal fungi in a boreonemoral forest. New Phytol. 2009;184(2):424–437.
doi: 10.1111/j.1469-8137.2009.02920.x.

для идентификации по LSU региону.
Интересным результатом этой работы является

то, что ~60% исследованных растений образовали симбиоз не менее чем с 10 видами АМ-грибов каждое, а 2% растений имели в корневой системе более 25 видов АМ-грибов
Применение данного протокола идентификации позволило получить 698297 последовательностей, из которых было обнаружено 0,17% целевых последовательностей АМ-грибов, отнесенных к 41 виду, из которых 15 – неизвестные таксоны, не зарегистрированные в базах данных.

Senes-Guerrero C, Schusler A. A conserved arbuscular mycorrhizal fungal core-species community colonizes potato roots in the Andes. Fungal Divers. 2015;77(1): 317-33.
doi: 10.1007/s13225-015-0328-7.

Illumina Miseq

широко распространенный и включающий наибольшее количество видов род Glomus содержит

113 “морфовидов”, а также 239 виртуальных таксонов , тем самым морфологически определены только 32% видов рода Glomus.

Opik M, Davison J, Moora M, Zobel M. DNA-based detection and identification of Glomeromycota: the virtual taxonomy of environmental sequences. Botany.
2014;92(2):135-147. doi: 10.1139/cjb-2013-0110.

Виды данной таксономической группы в 2010 г. были разделены на 4 рода – Glomus, Funneliformis, Rhizophagus, Sclerocystis, а к 2017 г. уже на 15 родов, многие виды из которых не определены морфологическими методами.

Amf-phylogeny.com [Internet]. Glomeromycota species list [cited 2018 Mar 1]. Available from: http://www.amf-phylogeny.com.


MaarjAM [Internet]. Database for studies on the diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Available at: https://maarjam.botany.ut.ee.
UNITE [Internet]. Unified system for the DNA based fungal species linked to the classification Ver. 7.2. Available at: URL:https://unite.ut.ee.

из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ до вида и 49 штаммов –

до рода.

Проведена оценка активности 65 штаммов АМ грибов и оценка симбиотической эффективности. Корреляционный анализ между параметрами активности и эффективности штаммов АМ грибов в условиях низкого и среднего уровня фосфора в почве показал, видоспецифичность этих параметров. Взаимосвязь с экотопом, из которого выделен штамм, отсутствует. Наиболее эффективные штаммы 14 и 16 принадлежат роду Rhizophagus.

3. Результаты работы свидетельствуют о перспективности внедрения биопрепаратов на основе АМ-инокулятов в сельское хозяйство России. Ряд штаммов рекомендованы к применению в качестве действующего начала биопрепаратов – усилителей роста растений.

Автор благодарит за помощь в проведении экспериментов и плодотворное обсуждение результатов к.б.н. Юркова А.П. д.б.н. Проворова Н.А., д.б.н. Шишову М.Ф.

Работа выполняется при финансовой поддержке
гранта РФФИ 15-29-02753 ОФИ-М (идентификация АМ-грибов и др.),
гранта СПбГУ №1.37.534.2016 (метаболомный и ФГ-анализ АМ-растений),
гранта РНФ №16-16-00118 (транскриптомный анализ АМ-растений)
с привлечением ресурсной базы ЦКП ФГБНУ ВНИИСХМ и РЦ МиКТ СПбГУ
(НИР №109-98 от 13.04.2014)