Получение иммунных антисывороток

антител.

Иммуногенность веществ сильно зависит от
1. молекулярной массы: чем выше

молекулярная масса, тем выше иммуногенность - сшивка биополимеров между собой и другими белками повышает иммуногенность:
- во-первых, увеличение времени пребывания антигена в организме при возрастании его молекулярной массы;
- во-вторых, у высокомолекулярных антигеноа существенно возрастает способность взаимодействовать с макрофагами,
- в-третьих, с увеличением молекулярной массы в антигене увеличивается как общее количество антигенных детерминант, так и их разнообразие, что повышает эффективность взаимодействия] антигенов как с B-, так и с T-лимфоцитами.

Иммуногенность антигенов

- по мере увеличения этих показателей иммуногенность в начале растет,

а затем начинает уменьшаться (например, из конъюгатов, содержащих 3, 16 и 28 групп на молекулу бычьего альбумина, максимальной антигенностью обладал конъюгат, содержащий 16 молекул гаптена) - сложность межклеточной кооперации - в иммунном ответе против антигенов, имеющих повторяющиеся антигенные детерминанты, участвуют только В-лимфоциты; такие антигены называются независимыми.
3. Очень важным является понятие "чужеродность" иммуногена - чем более антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность - генетической чужеродностью антигена.
Чем менее "чужеродный" антиген, тем большее количество животных следует брать для иммунизации.
Смесь антисывороток против данного антигена от разных животных одной группы называют пулом.

свинок или мышей в зависимости от количества имеющегося антигена, доступности

животного и т.д.
Иммунизировать удобнее самцов, так как у них иммуногенный ответ менее подвержен влиянию гормональных циклов.
Для получения антител против вирусов эффективными оказались куры, у которых антитела накапливаются в яйцах.
Большие количества антисывороток получают иммунизацией крупных животных: козлов, баранов, ослов, лошадей.

4. Для получения специфических антисывороток важное значение имеет гомогенность антигена (примеси чужеродных антигенов могут обладать большей иммуногенностью, чем основной антиген).

При определенных концентрациях антигена, как высоких, так и низких, наступает

торможение гуморального иммунного ответа, называемое толерантностью.
Это обусловливает необходимость выбора оптимальной дозы.
Доза иммуногена для одной инъекции кролику или морской свинке составляет в среднем 100-300 мкг на 2 кг массы.
Доза для овец - 0,25-5 мг иммуногена на инъекцию, для осла - 0,5-10 мг.
6. Способ введения антигена и периодичность введения влияют на иммунологическую активность антисывороток (иммунный ответ формируется в организме постепенно - первичный ответ и вторичный ответ).
Обычно высокоактивные антисыворотки получают после нескольких циклов иммунизации.
Но очень длительные иммунизации могут привести к снижению специфичности из-за увеличения титра антител к примесным антигенам.

неспецифическое усиление иммунного ответа и тем самым повышают способность организма

реагировать на любой иммуноген.
Адъювантными свойствами обладают масла, липосомы, клетки бактерий, полимеры и др. Адъюванты, введенные в организм вместе с иммуногеном, выполняют две функции.
Во-первых, они способствуют более медленному освобождению иммуногена из участков инъекции, в результате чего увеличивается вероятность встречи иммуногена с иммунокомпетентными клетками, а также резко снижается его токсичность.
Во-вторых, адъюванты вызывают сильное воспаление в месте введения иммуногена, при этом активируется фагоцитоз и стимулируется местная циркуляция лимфоцитов, происходит неспецифическая стимуляция иммунокомпетентных клеток (для усиления неспецифической иммуностимуляции в состав адъюваитов дополнительно включают препарат клеток рода Bacilluspertussium).

Получение иммунных антисывороток

опубликовали данные, о том, что эмульсии минеральных масел способны повышать

иммунный ответ на АГ.
Термин «иммунологический АД» был впервые использован в 1920-е гг. Гастоном Раймоном для описания субстанции, которая при введении в комбинации со специфическим АГ, позволяла получить более выраженный иммунный ответ, чем чистый АГ.
Адъювантная активность соединений алюминия была впервые продемонстрирована в 1926 г. на примере дифтерийного анатоксина, адсорбированного на гидроксиде алюминия, что позволило значительно снизить дозы антигенов при иммунизации и увеличить тем самым безопасность. С тех пор гидроксид алюминия или фосфат алюминия широко применяются при создании антисывороток и вакцин, используемых для иммунизации людей.

адъюванта Фрейнда:
- смесь минеральныхмасел,
- эмульгатор,
- убитые микобактерии.
Препарат адъюванта можно

приготовить в лабораторных условиях смешав:
- три части минерального масла,
- одну часть безводного ланолина,
- четыре части 0,15 M К-фосфатного буфера
- препарат микобактерии до конечной концентрации 10 мг/мл так, чтобы частички микобактерии равномерно распределились по всему объему,
Адъювант смешивают с водным раствором иммуногена в отношении 2: 1 до образования нерасслаивающейся эмульсии, в которой водный раствор иммуногена находится в мицеллах.

расширить диапазон вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на

одну инъекцию.
После введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы. В случае ухудшения самочувствия очередную инъекцию пропускают и лишь после выздоровления животного продолжают иммунизацию.

Способы иммунизации.
Наиболее эффективно вводить иммуноген малыми порциями в большое количество точек.
Внутрикожное введение.На очищенном от шерсти участке кожи животного делают скальпелем несколько царапин, а затем втирают в это место раствор иммуногена.

чего значительно сокращается расход иммуногена.
«-» способ трудоемок в исполнении

и обычно вызывает сильные болевые ощущения у животного от обширных участков изъязвлений в местах введения иммуногена.
Подкожная иммунизация. В точки, расположенные вдоль позвоночника животного, вводят 5-6 порций раствора иммуногена объемом приблизительно 2 мл.
Внутримышечное введение. Одновременно часть иммуногена вводят в мышцу задних ног животного и небольшими порциями.
Внутрибрюшинное введение. Этот способ используют для иммунизации мелких лабораторных животных, таких, как мыши или морские свинки.

узлы, расположенные в подколенной ямке задних ног кролика.
«+» позволяет

уменьшить количество иммуногена до 10-50 мкг, а объем вводимого раствора - до 25 мкл.
«-» способ является сложным в техническом исполнении (разрез кожи, поиск лимфоузла и введение иммуногена без его повреждения).

Внутривенное введение. Этот способ обычно применяется для повторных инъекций, после которых проводят отбор крови у животного.
Раствор иммуногена вводят непосредственно в кровоток.
Адъювант в этом способе введения антигена не применяется, поскольку животное может погибнуть.

начинают введением животному иммуногена в смеси с полным адъювантом Фрейнда,

а для повторных инъекций применяют неполный адъювант Фрейнда.
Перед отбором крови за 7 - 9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител.
«-» вызывает сильные болевые ощущения у животного.
В процессе иммунизации у животных отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител.
Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции.
В случае, когда иммуногеном являются клетки микроорганизмов, максимально высокий уровень антител наблюдается раньше.
После окончания первого цикла иммунизации животному в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию (1-3 внутривенные инъекции).

инсулина подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинно по следующей схеме:
1) 1, 8,

15-й день - 200 мкг инсулина в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюваита Фрейнда и вводят животному. 30 дней отдыха.
2) 45, 46, 47-й день - 150 мкг инсулина в 0,7 мл физиологического раствора.
3) Отбор крови проводят через 7-9 дней из сердца.
Второй цикл иммунизации осуществляется после месячного отдыха животных по схемам 45, 46 и 47 дней.
Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4-5-кратное повторение циклов иммунизации.
Отбор крови каждый раз проводится на 7 - 9-й день после последней инъекции.

позвоночника и внутримышечно в область микроузлов задних лап по следующей

схеме:
1) 1-й день - 1-2 мг конъюгата T4 - БСА в 0,7 мл физиологического раствора смешивают с 0,7 мл адъюванта Фрейнда и полученную эмульсию вводят животному;
2) 31, 32, 33 или 45, 46, 47-й дни - внутривенно вводят 0,7-1 мл физиологического раствора, содержащего 1-2 мг T4 - БСА.

Кровь берут из сердца на 7-9-й день после последней инъекции.

Через месяц цикл внутривенной иммунизации, повторяют.

донора иммунной сыворотки в течение 5-7 мес. (5-6 циклов иммунизации).

Животных, прошедших несколько циклов иммунизации, называют гипериммунными.
Кровь отбирают:
- из вены уха,
- из сердца (путем кардиальной пункции)
в объеме 50-70 мл у кролика и 5-10 мл у морской свинки в стерильные пробирки, промытые стерильным буферным раствором.

приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который

осторожно удаляется центрифугированием при 1000-2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой.
Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность.
Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения эритроцитов.
Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сыворотке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа.

потери иммунологической активности в замороженном состоянии при - 20°С, предварительно

разливая ее во флаконы по 0,5-1 мл.
Отмораживание-замораживание ведет к снижению иммунологической активности сыворотки.
Удобно хранить антисыворотку в лиофилизованном состоянии в ампулах под вакуумом. В сухом виде антисыворотка сохраняет иммунологическую активность при комнатной температуре в течение 1-2 лет.
Размороженную или разведенную сухую сыворотку в растворе можно хранить при +4°С в течение недели, предварительно добавив в нее консервант - хлороформ, 0,1% азида натрия или 0,01% мертнолата.
Консерванты могут быть ингибиторами ферментов-маркеров в иммуноферемнтном анализе.

наиболее широко используются соединения алюминия. Помимо них, в качестве АД

при производстве вакцин применяются и другие вещества, такие как эмульсии, липосомы и виросомы.
Эмульсии - «масло в воде» и «вода в масле», такие, например, как неполный АД Фрейнда.
Липосомы - это синтетические сферические частицы, состоящие из бимолекулярного слоя липидов, удерживающего АГ в капсуле, и выполняющие двойное действие, выступая в качестве носителя АГ вакцины и имуномодулятора.
Виросомы - в липосомы включающие кроме антигена (вирусный капсид) еще белки, способствующие слиянию мембран липосом и клеток.

монофосфорил липид А (MPL),
- QS21.
CpG (CpG-олигодезоксинуклеотиды) — короткие

одноцепочечные синтетические молекулы ДНК, содержащие цитозин «C», и гуанин «G», «p» - фосфодиэфирный компонент ДНК - действуют как сигналы опасности для клеток иммунной системы позвоночных и активируют врожденный и приобретенный иммунный ответ. CpG, содержащие олигодезоксинуклеотиды, обладают существенно большей активностью по сравнению с адъювантом Фрейнда.
QS-21 - очищенный растительный экстракт, увеличивает способность иммунной системы реагировать на антигены. Его получают из коры мыльного дерева (Quillaja saponaria). Экстракт содержит растворимые в воде тритерпеновые глюкозидные соединения, относящиеся к сапонинам.

стимулятора иммунной системы, адсорбированного на различных соединениях алюминия.

1. Вакцина,

содержащая адъювант AS04, разрешенная к применению у людей — это вакцина с поверхностным АГ вируса гепатита В (позволяет получить высокий титр специфических антител и повышенный уровень серопротекции при меньшем количестве необходимых доз по сравнению с классической вакциной от гепатита В в комбинации с соединениями алюминия).
«+» При использовании вакцины с адъювантной системой AS04, защитный уровень антител сохраняется дольше при меньшем количестве необходимых доз.

2. Вакцина против рака шейки матки, направленная против папиломавируса человека (HPV) 16 и 18 типов также содержит адъювантную систему AS04.