Производство аминокислот

промышленности (около 30 % производимых аминокислот):
Цистеин - предотвращает пригорание

пищи, улучшает качество хлеба при выпечке, усиливает запах пищи;
Глицин - обладает освежающим, сладковатым вкусом, используется при производстве напитков;
Глутаминовая кислота – для усиления вкуса и консервирования пищи;
2) в медицинской и фармацевтической практики:
лекарственные препараты, смеси для ЛП, для терапии послеоперационных больных, язвенной болезни, печени, психических заболеваний
(серотонин, аспарагин, валин, гистидин, глицин и др.);

используют как предшественники :
в производстве детергенов,
в производстве полиаминокислот,

в производстве полиуретана и т.п.;
4) в сельском хозяйстве:
как кормовые балансирующие добавки.

Существует 4 способа промышленного получения незаменимых аминокислот:
1) гидролиз природного белоксодержащего сырья;
2) химический синтез;
3) микробиологический синтез;
4) биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

гидролиза используют:
отходы мясоперерабатывающей промышленности
(отходы обработки животного сырья, кровь и

т.д.),
яичный белок,
казеин молока,
клейковина пшеницы,
соевый шрот и т.д.

При гидролизе белоксодержащее сырье нагревают с растворами кислот и щелочей, при температуре от 100 до 105 ºС в течение 20…48 часов. При этом аминокислоты переходят в гидролизат.

включающую в себя:
нейтрализацию среды выделения,
ионообменную хроматографию,
аффинную хроматографию,

концентрирование АК,
лиофилизацию АК с последующей фасовкой.
Основные недостатки данного способа:
Сложность процесса выделения и очистки,
Кроме того, само сырье считается дефицитным и дорогим, поэтому аминокислоты имеют высокую себестоимость.
Часть аминокислот может разрушиться (таких как триптофан, цистеин, метионин, тирозин),
Происходит рацемизация.

по объему производства (около 30%).

Основные недостатки химического синтеза:
1.

Получение смеси аминокислот, состоящей из D- и L-изомеров (биологической активностью в организме человека и животных обладают лишь L-изомеры).
Некоторые из D-изомеров токсичны для человека и животных.
Исключением в этом отношении является метионин, у которого биологически активными являются как D-, так и L-изомеры, в связи, с чем данная аминокислота производится преимущественно путем химического синтеза.

токсических соединений в качестве исходного сырья.
3. Процесс, как правило,

протекает при высокой температуре,
4. Требует дорогостоящих катализаторов,
5. Сопровождается образованием побочных продуктов,
6. Загрязняет окружающую среду,
7. Небезопасно и вредно для обслуживающего персонала.

препаратов аминокислот получают путем микробиологического синтеза.
Данный способ производства

аминокислот включает в себя биосинтез аминокислот высокоактивными штаммами-продуцентами и технологические операции по получению различных товарных форм.
При микробиологическом синтезе образуются только L-аминокислоты.
Чаще всего для синтеза аминокислот используют ауксотрофные мутантные штаммы.
На основе культивирования микроорганизмов для получения чистых препаратов аминокислот применяют промышленные технологии, включающие одно- и двухступенчатый синтез аминокислот.

мутанты, являющиеся сверхпродуцентами аминокислот.

После завершения рабочего цикла их выращивания:

культуральную жидкость отделяют от клеток микроорганизмов,
культуральную жидкость сгущают,
получают из нее товарный продукт с высокой концентрацией синтезированной микробами аминокислоты.

получают предшественника аминокислоты (часто более дешевым химическим синтезом),

с помощью ферментов, вырабатываемых микроорганизмами, превращают предшественник в аминокислоту, при этом образуется только L-изомеры.
В качестве источника фермента могут быть использованы суспензия клеток микроорганизмов или полученный после разрушения этих клеток ферментный раствор.
Этим методом можно производить практически все аминокислоты, но из-за дороговизны и сложности получения кислот-предшественников этот метод не всегда экономически выгоден и в большинстве случаев уступает методу прямого микробиологического синтеза.

генетически измененные штаммы, обладающие способностью к сверхсинтезу аминокислот.

Лучшими продуцентами

аминокислот являются ауксотрофные мутанты (микроорганизмы, лишенные ряда ферментных систем, поэтому очень требовательны к составу питательной среды, в которой должно присутствовать большое количество факторов роста).
В качестве продуцентов аминокислот используют грамположительные бесспоровые бактерии родов :
Corynebacterium,
Brevibacterium,
Micrococcus.

аминокислот бактерии стали использовать с начала 50-х гг., при этом

штаммы бактерий постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами.

Образовывать аминокислоты способны бактерии многих родов:
Виды Corynebacterium или Brevibacterium, выращиваемые на углеродном сырье, на этиловом спирте или ацетате при наличии достаточного количества биотина в питательной среде способны синтезировать до 30 г/л глутамата.

Производство аминокислот с помощью
ауксотрофных мутантов

антибиотиков,
Добавление ПАВ и жирных кислот.

Путем изменения условий среды

процесс ферментации, в ходе которого образуется L-глутамат, может быть переключен на синтез L-глутамина или L-пролина:
- при высокой концентрации биотина и ионов аммония создаются благоприятные условия для образования L-пролина,
- при больших концентрациях ионов аммония и цинка в слабо кислой среде усиливается синтез L-глутамина.

разветвленных цепей метаболических реакций:
Например: L-аспартат является общим предшественником для

L-лизина, L-треонина, L-метионина и L-изолейцина.
Первая реакция в процессе образования этих аминокислот катализируется аспартокиназой, активность, которой может быть ингибирована по механизму отрицательной обратной связи при совместном действии L-лизина, L-треонина.
У мутантов ауксотрофных по гомосерину или треонину (метионину) существенно уменьшается внутриклеточная концентрация L-треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам накапливать L-лизин.

мутанты способны накапливать конечные продукты неразветвленных путей биосинтеза.

В таких случаях приходится отбирать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты называются регуляторными, их отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот или среди ревертантов ауксотрофов.
В основе использования аналогов аминокислот лежит сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей аминокислоты.
Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных, работающих по принципу отрицательной обратной связи, ингибиторов ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот и одновременно подавляют процесс включения их в белки.

как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно.
Например: у Corynebacterium

glutamicum и Brevibacterium flavum сверхпродукции L-треонина не наблюдается, т.к. не происходит сочетанного ингибирования по механизму отрицательной обратной связи аспартокиназы L-треонином, и L-лизином, а L-треонин ингибирует гомосеридегидрогеназу.
Мутант, устойчивый к аналогу треонина синтезирует в избыточном количестве треонин, т.к. его ферменты ингибированные этой аминокислотой, десенсибилизированы.
Гомосеридегидрогеназа и киназа, принимающие участие в синтезе треонина также «выключаются» L-метиокином, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим выходом.
Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции, проводя отбор мутаций, вызывающих полное рассогласование регуляторных механизмов, затем объединяя эти признаки путем трансдукции.

аминокислота, полученная путем промышленного микробиологического синтеза;
важнейшая аминокислота растительных

и животных белков, не относится к незаменимым;
глутамат натрия усиливает вкус пищевых продуктов,
способствует длительному сохранению вкусовых качеств консервированных продуктов;
за рубежом глутамат натрия добавляют во все продукты не только при консервировании, но и при замораживании и просто хранении;
глутаминовая кислота стимулирует пищеварение.
Производство глутаминовой кислоты является крупно-тоннажным биотехнологическим производством (> 400 000 т/ г).
Ведущие страны–производители - Япония и США.

Получение глутаминовой кислоты

- микроскопические грибы,
- бактерии (обеспечивают наибольший выход).
Бактерии - продуценты:

Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium.
Сверхсинтез кислоты возможен при торможении скорости роста и увеличении проницаемости клеточной мембраны для глутаминовой кислоты:
наличие биотин (1–5 мкг/л),
присутствие некоторых антибиотиков
высокая концентрация аммония в среде,
высокая активность НАД(Ф)Н-зависимой глутаматдегидрогеназы,
отсутствие или дефект -кетоглутарат-дегидрогеназы.

питательной среды.
- Питательная среда

содержит 5 % сахарозы, 1 % мочевины, 1,5 % мелассы и по 0,1 % сульфата магния, одно- и двухзаме-щенного фосфата калия; рН 6,8 – 7,5; температура 30 °С.
- Инкубация на каждой стадии длится 24 ч.
- Инокулят готовят в аэробных условиях на среде такого же состава в ферментерах объемом 200 л и 5 м3 до получения 6–8 г/л сухой биомассы.
2. Производственное культивирование:
- Инокулят (5–6 %) переносят в главный ферментер объемом 50 м3, 70 % общего объема которого занимает питательная среда следующего состава: 8,5–10 % сахарозы, 1,2 % мелассы, 0,5 % мочевины, по 0,1 % одно- и двухзамещенного фосфата калия, по 0,01 % сульфата марганца и сульфата цинка.

Интенсивность аэрации – 40–45 мг О2 л/мин, рН 7,8–8,0, температура

– 30 °С.
- Ферментация длится 2 сут. (за это время в среде накапливается глутаминовой кислоты до 50 г/л).
3. Освобождение целевого продукта из биомассы методом центрифугирования. Фильтрат осветляют активным углем.
4. Концентрирование культуральной жидкости в выпарном аппарате до 40–50 % абсолютно сухого вещества при температуре не выше 70 °С.
5. Кристаллизация и последующее подкисление целевого продукта до рН 3,2 и охлаждение его до 15 °C до тех пор пока в маточном растворе остается не более 20–30 г глутаминовой кислоты.

добавляют:
- негашеную известь или известковое молоко,

- затем избыток ионов осаждают кислотой,
- осадок удаляют центрифугированием.
2. фильтрат осветляют активированным углем
3. сорбируют на ионообменных смолах
4. концентрируют вакуум-выпариванием при 40–60 С.
5. Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты проводят в изоэлектрической точке (рН 3,2 при 4–15 С).
В результате перекристаллизации чистота продукта достигает 99,6 %.
7. кристаллы кислоты отделяют от маточника центрифуги-рованием, промывают и сушат.

1. влажные кристаллы растворяют в воде,
2. нейтрализуют 40–50 %

раствором едкого натра,
3. полученный раствор фильтруют,
4. упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ 60 %
5. направляют на перекристаллизацию,
6. полученные кристаллы глутамата натрия выделяют из маточного раствора центрифугированием,
7. высушивают током горячего воздуха.
Содержание чистого вещества составляет 98 %.

является предшественником карнитина и оксилизина,
- способствует секреции пищеварительных ферментов
-

способствует транспорту кальция и стронция в клетки,
- улучшает общий азотный баланс в организме.

Наиболее дешевым и освоенным способом получения лизина является микробиологический метод.

Впервые такое производство налажено в Японии в середине 50-х гг.; затем в Голландии и США.

Микробиологический синтез лизина

является предшественником карнитина и оксилизина,
- способствует секреции пищеварительных ферментов
-

способствует транспорту кальция и стронция в клетки,
- улучшает общий азотный баланс в организме.
Наиболее дешевым и освоенным способом получения лизина является микробиологический метод.
Впервые такое производство налажено в Японии в середине 50-х гг.; затем в Голландии и США.
Продуцентами лизина являются - бактерии, актино-мицеты, сине-зеленые водоросли.
Сейчас получены штаммы, способные вырабатывать до 60 г/л и более аминокислоты.

культивирование ауксотрофных мутантов бактерий из рода Corynebacterium) .

питательной среде обеспечивают высокий выход лизина.
Дефицитные аминокислоты, которые не

синтезируются мутантными клетками (гомосерин, треонин, метионин), вводятся в состав питательной среды в таком количестве, чтобы они не были регуляторами синтеза лизина.
В процессе культивирования микроорганизмов обеспечивается подача стерильного воздуха с помощью специальных турбинных мешалок, для предотвращения вспенивания субстрата и клеточной суспензии в среду культивирования добавляют пеногасители.

уксусную кислоту и свекловичную мелассу, небольшие добавки сахара (1 %)

повышают выход лизина на 30–50 %;
- в качестве источника азота – соли аммония, мочевину, кукурузный экстракт
- в качестве источника биологически активных веществ (1,2–1,5 % по содержанию сухих веществ), гидролизаты дрожжей.
- дефицитные аминокислоты - гомосерин, треонин, метионин.
- необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов микро- и макроэлементы, витамины (биотин и др.).
- среда должна содержать (в л): 200 мг метионина, 800 мг треонина, 15–20 мкг биотина.
- соотношение углерода и азота оптимально как 11: 1.

°C, рН 7–7,2 в течение 18–24 ч.
Суспензия клеток подается

в ферментеры, в которых поддерживается постоянный режим аэрации, избыточное давление 20–30 кПа, непрерывное перемешивание, контроль за всеми параметрами среды.
Культивирование осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре.
Время ферментации составляет 55–72 ч.
Накопление в культуральной жидкости лизина начинается через 25–30 ч после начала выращивания промышленной культуры и к концу ферментации достигает 40–50 г/л.
Культуральную жидкость отделяют от культуры клеток продуцента фильтрованием и используют для получения лизина.

концентрат лизина (ККЛ), высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты .

1. ЖКЛ получают выпариванием культуральной жидкости на ваккум-выпарной установке до концентрации 40 %. Для предотвращения деградации лизина при нагревании добавляют бисульфит натрия и соляную кислоту до рН 4,5–5,0, в результате образуется соль – монохлоргидрат лизина.
2. Сухой кормовой концентрат лизина - жидкий концентрат сушат горячим воздухом на распылительной сушилке при 90 С до влажности 4–8 % (препарат содержит 15–20 % монохлоргидрата лизина, 15–17 % белков, 14 % аминокислот, витамины группы В, минеральные вещества). Далее высушивают на вальцово-ленточной сушилке и гранулируют. Гранулированный препарат ККЛ негигроскопичен, содержит 7–10 % лизина.

фильтрования подкисляют соляной кислотой до рН 1,6–2.
Образовавшийся раствор монохлоргидрата

лизина направляют на колонки с катионитом.
Затем проводят десорбцию аминокислоты элюированием 0,5–5 % раствором аммиака.
Элюат выпаривают под вакуумом при 60 °C до концентрации 30–50 %.
После подкисленный соляной кислотой раствор монохлоргидрата высушивают.
Путем перекристаллизации полученной соли можно получить препараты с содержанием монохлоргидрата лизина в количестве 97–98 %

заболеваний (диабет, туберкулез, пеллагра).
Для производства триптофана применяют:
- одноступенчатый

синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза аминокислот;
- двухступенчатый синтез, включающий вначале получение предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в триптофан .

Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую, что достигается действием мутагенных факторов.

Микробиологический синтез триптофана

фенилаланина и тирозина.
Все технологические процессы организованы по той же

схеме, что и получение лизина. Ферментация длится 48 ч при 37С, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л

Синтез триптофана в нашей стране производится преимущественно по двухступенчатой схеме:
- Вначале методом химического синтеза получают предшественник триптофана – антраниловую кислоту
- Антраниловую кислоту затем с участием ферментов микробного происхождения превращают в триптофан.

- на I этапе из антраниловой кислоты с участием фосфорибозилпирофосфата

образуется аминогликозид-N-(5-фосфорибозил)-антраниловая кислота,
- на 2 этапе аминогликозид-N-(5-фосфорибозил)-антраниловая кислота в результате внутримолекулярной перегруппировки и декарбоксилирования превращается в индол-3-глицерофосфат.
- на 3 этапе под действием фермента триптофансинтетазы из индол-3-глицерофосфата и серина образуется триптофан.
В качестве активной группы у фермента триптофансинтетазы служит пиридоксальфосфат. В качестве источника ферментов используют дрожжи .

две стадии.
- На I стадии производится наращивание биомассы дрожжей,

являющихся продуцентами ферментов.
Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелассы, мочевины, минеральных солей.
Ферментация продолжается в течение 24 ч при 30 С.
Далее в ферментер вводят спиртовой 5 % раствор антраниловой кислоты и 50 % раствор мочевины.
Через 3–4 ч после добавления антраниловой кислоты в ферментер дополнительно подается меласса в виде 25 % раствора.
На последующих этапах ферментации периодически производится подача антраниловой кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы – через каждые 12 ч.
Длительность ферментации около 120 ч, а с учетом времени наращивания биомассы дрожжей – 144 ч .