Тема: Микробиологическая лаборатория и ее задачи. Микроскоп и работа с ним

Морфология шаровидных бактерий.
Техника безопасности в лаборатории

лаборатории.

2. Изучить методы исследований, применяемые в микробиологической практике.

3. Изучить устройство

микроскопов и правила работы с ними.

4. Изучить морфологию шаровидных бактерий по рисункам, муляжам, зарисовать.

5. Освоить методику микроскопирования убитых микробов в готовых окрашенных препаратах в сухой и иммерсионной системе, методику определения подвижности микробов в препарате «раздавленная капля", зарисовать.

имеют дело с микроорганизмами, которые далеко не всегда могут быть

безвредными для окружающей среды и здоровья человека. Поэтому при работе в микробиологической лаборатории необходимо всегда соблюдать следующие правила личной и об- щественной безопасности:

воду, не допускать излишних разговоров и хождения.
3. Работать только

за своим рабочим местом и прикрепленным к нему оборудованием.
4. Работать сидя, после окончания работы тщательно продезинфицировать и вымыть руки с мылом.
5. Использованную посуду, стекла помещают в 1 %й раствор хлорамина. Пинцеты и бактериологические петли фламбируют.
6. Стол, одежду, обувь и другие предметы, случайно загрязненные исследуемым материалом или культурой микроорганизмов, подвергают дезинфекции.
7. После окончания работы нужно поставить в термостат засеянные чашки и пробирки. Культуры микробов и остатки исследуемого материала сдать преподавателю, рабочее место привести в порядок.

– включает в себя приготовление мазков, окраску их по Граму,

окраску специальными методами и последующее микрокопирование.

Бактериологический метод – включает в себя посевы на обычные и специальные питательные среды с целью изучения культуральных, тинкториальных и биохимических свойств чистой культуры.

Биологический метод (метод биопробы) – заключается в определении патогенных микроорганизмов путём заражения лабораторных животных.

Серологический метод – основывается на идентификации бактерий по сыворотке крови, взятой от больного или переболевшего животного в различных серологических реакциях.

мелких объектов невозможно без использования увеличительных приборов. Размеры бактерий и

микроскопических грибов измеряются в микрометрах (10-6м), поэтому для изучения их морфологии требуется достаточно большое увеличение, которое обеспечивают различные виды микроскопов.
В лабораториях, как правило, имеются световые микроскопы, т.е. для освещения микроорганизмов используют либо естественное, либо искусственное освещение (от лампы накаливания). На следующем рисунке представлен монокулярный микроскоп. В нашей стране бинокулярные микроскопы марки ЛОМО производят на Ленинградском оптико-механическом объединении (г. Санкт-Петербург).

тубусодержателю прикреплены: револьвер, вращающийся диск с гнездами для объективов и

предметный столик с клеммами, препаратоводителем. Тубус передвигают вверх-вниз при помощи макро- и микрометрических винтов. Тубус соединен с тубусодержателем головкой на резьбе с помощью винта.

Оптическая часть микроскопа:
осветительный аппарат (зеркало или лампа искусственного освещения), конденсор, диафрагма, светофильтры, объективы и окуляры.

механизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится

в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов.
Макрометрический винт (макровинт) служит для ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта.
Микрометрический винт (микровинт) используют для получения более контрастного изображения объекта, изменяя фокусное расстояние. При полном повороте микровинта труба передвигается на 0,1 мм (100 мкм).

к препарату, при вращении против часовой стрелки — наоборот.
Предметный столик

служит для размещения на нем препарата с объектом исследования и фиксации его на столике с помощью препаратодержателя. Предметный столик перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов препаратоводителя. В центре столика находится круглое отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалом или лампочкой.

служит для перемещения конденсора с целью регулирования светового потока, идущего

от зеркала или лампочки. Для этой же цели в сам конденсор вмонтирована рукоятка диафрагмы.
При поднятии конденсора и раскрытии диафрагмы освещенность объекта максимальна, при опускании конденсора и закрытии диафрагмы – наоборот минимальна.
Тубус (труба) — оправа, в которую вставлен окуляр микроскопа. К нижней части тубуса прикрепляется револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов.

сгущаю), состоящий из 2—3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от

зеркала или лампочки, и направляет их на объект. Конденсор необходим прежде всего при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу. Интенсивность освещения в конденсоре регулируется ирисовой (лепестковой) диафрагмой, состоящей из стальных серповидных пластинок.
Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные – при уменьшенном отверстии диафрагмы.

прилагаются синее и белое матовые стекла). При работе с искусственным

источником света светофильтры создают впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.
Объектив (от лат. objectum — предмет) — наиболее важная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. К препарату обращена фронтальная линза объектива. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов.

объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух.

Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в жидкую однородную среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз исследователя. При работе с иммерсионным объективом необходимо поместить между покровным стеклом и линзами объектива кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла.

Иммерсионные объективы на оправе имеют черную круговую нарезку и обозначения:

I — immersion (иммерсия), HI — homogen immersion (однородная иммерсия),
01 — oil immersion, МИ — масляная иммерсия.
Объективы различают по их увеличению.

– оптическая длина тубуса или расстояние между фокальной плоскостью объектива

и плоскостью изображения, составляющее для разных объективов 128–180 мм;

f – фокусное расстояние объектива: чем оно больше, тем меньше увеличение объектива.

Каждый объектив характеризуется, кроме того, определенной величиной рабочего расстояния в

миллиметрах.
У объективов с малым увеличением расстояние от фронтальной линзы объектива до препарата больше, чем у объективов с большим увеличением. Так, объективы с увеличением 8х, 40х и 90х имеют соответственно рабочие расстояния 13,8; 0,6 и 0,12 мм. расстояние до объектива 0,12 мм, поэтому его нередко называют «близоруким».

линз – глазной (верхней) и полевой, или собирательной (нижней), заключенных

в металлическую оправу. Назначение полевой линзы – собирать лучи, идущие от объектива, таким образом, чтобы они проходили через маленькое отверстие глазной линзы.
Увеличение окуляра указано на его оправе. Рабочее увеличение окуляров колеблется в пределах от 4х до 15х.

наилучшего зрения, равное 25 см;
F – фокусное расстояние

линз окуляра.

бинокулярной насадкой. Бинокулярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5х)

и снабжены коррекционными линзами. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55–75 мм, в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя.

Коэффициент увеличения микроскопа определяется произведением увеличения окуляра (К) и увеличением

объектива (V):

Тиндаля – рассеивающийся пучок света при наблюдении сбоку имеет вид

голубоватого конуса на темном фоне. При освещении объекта косыми лучами света эти лучи, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит темным, но оптически неоднородные клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой степени, что лучи попадают в объектив. Поскольку лучи света идут именно от объектов, исследователь видит их в темном поле интенсивно светящимися.

Он основан на преобразовании фазовых изменений, претерпеваемых световой волной при

прохождении через объект, в видимые амплитудные с помощью определенного оптического устройства:
фазово-контрастное устройство состоит из фазовых объективов (на оправе имеется буква «Ф»), конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста

лучами (сине-фиолетовыми, ультрафиолетовыми) поглощать их и испускать лучи с более

длинной волной. При этом клетки будут светиться желто-зеленым или оранжевым светом. Это собственная, или первичная, люминесценция.

желтым, акридином оранжевым, аурамином, примулином, тиофлавином, конго красным, калькофлером белым)

и также наблюдать люминесценцию. Это будет наведенная, или вторичная, люминесценция.
Препараты, окрашенные флуорохромами, изучают в средах, не люминесцирующих под действием коротковолновых лучей: в воде, глицерине, вазелиновом масле или физиологическом растворе.

не лучами света, а потоком электронов. Трансмиссионный электронный микроскоп состоит

из электронной пушки, электромагнитных катушек, которые выполняют роль конденсорной, проекционной и объективной линз, предметного столика, экрана, окуляра и вакуумного насоса. Исследуются целые клетки и срезы клеток. Сканирующий электронный микроскоп дает трехмерное изображение объекта. Разрешающая способность электронных микроскопов достигает 0,2–0,4 нм, увеличение – 100 000 раз.

окраска, иммерсия, объектив 90х15)
4. Изучить морфологию шаровидных бактерий по

рисункам, муляжам, зарисовать

– стрептококки (Streptococcus),
4. – стафилококки (Staphylococcus),
5 – сарцина

(Sarcina),
6 – бактерии, 7 – спириллы, 8 – вибрионы

стрептококк
5 – сарцина
6 - стафилококк

– диплококки; 3– стрептококки; 4 – тетракокки;

5 – сарцина; 6 – стафилококки

1 – эшерихии; 2 – клебсиеллы; 3 – бруцеллы; 4 – бациллы; 5 – коринебактерии; 6 – фузиформные бактерии; 7 – клостридии; 8 – иерсинии; 9 - вибрионы

В обоих случаях окрашивание объекта проводят «прижизненными» красителями – витальная

окраска. Прижизненными красителями могут служить метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.
Оба метода применяют для выявления подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их расположения, определения запасных веществ в клетке.

света регулируют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением – объектив

8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х). Более четкие результаты можно получить при микроскопии в темном поле или в фазовом контрасте.

каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с

водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла. При просмотре приготовленного препарата под микроскопом с иммерсионным объективом на покровное стекло наносят каплю кедрового масла.

крупных объектов – микроскопических грибов, дрожжей. Его применяют также при

изучении запасных веществ клетки.

Для него требуется специальное предметное стекло с лункой посередине. На

стерильное покровное стекло наносят иглой негустую суспензию микроорганизмов, выращенных в жидкой питательной среде или подготовленных для данной цели. При выращивании на плотной среде микроорганизмы предварительно разводят в физиологическом растворе (0,5% NaCl). Покровное стекло переворачивают и помещают на стерильное предметное стекло с лункой так, чтобы капля свободно свисала в лунку. Для герметичности края лунки смазывают вазелином.

палочек составляет 0,3–1,5 мкм, а длина палочковидных бактерий может достигать

10 мкм. Максимальную длину клеток имеют спирохеты – до 500 мкм, но они остаются невидимыми в связи с ничтожно малым диаметром их клеток.

– лофотрихи; 4 - перитрихи

центральное,
2 – бациллярное терминальное, 3 и 5 – плектридиальное,

4 – клостридиальное,
6 – латеральное

– бациллы сибирской язвы; 2 – клостридии столбняка; 3

– клостридии ботулизма