Трансгенные животные в биотехнологии Лекция 2

которая произошла в XIV веке . Обнаружено, что, во-первых, за

прошедшие с эпидемии 660 лет у бактерии лишь немного изменилась структура всего 12 генов (из 4200), а во-вторых, все известные сейчас штаммы чумной палочки являются потомками ныне восстановлен-ной Y. pestis. Почему же была эпидемия чумы?

Что нового в 2011 г. в молекулярной генетике?

2) Расшифровали геном голландки, дожившей до 115 лет без каких-либо признаков старческого слабоумия. Пока выявили у женщины ряд мутаций, связанных с пониженным риском болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, а также атеросклероза. Идет поиск «генов долголетия».

3) Суицидальное поведение записано в генах человека, установили ученые, проанализировав данные, собранные в самой большой в Канаде психиатрической лечебнице.
4) Вегетарианство имеет генетическую причину и связано с наличием у человека дополнительных копий определенного гена.
5) Обнаружены «гены худых людей».

ГСК

СХСR4 Увеличение длительности Brenner et al., 2004
(рецептор культивирования, усиление
хемокина) миграции в сторону стро-
мального фактора

МСК TERT Увеличение продолжительности Abdallah et al., 2005
(теломераз- жизни, стабильность фенотипа
ная ревертаза)

ГСК HOXB4 Усиление воспроизводства, Schmittwolf, 2005
(фактор стабилизация скорости
транскрипции) пролиферации

ГСК BCL-2 Повышение жизнеспособ- Orelio et al., 2004
(антиапоптоти- ности и активности
ческий фактор)

регенеративной медицины

глобиновый ген анемия

Sadelain e a, 2004

ГСК аллель ГКГ кл. II диабет типа 1 Tian et al., 2004

ЭСК ген сульфамидазы мукополисахаридоз Lau et al., 2004

МСК ген ß-интерферона карцинома Studeny e a., 2004

ГСК ген фактора VIII гемофилия Moayeri, 2004

ГСК ген WAS синдром Dupre et al., 2004
Вискотт-Алдриха

ГСК ген феррохелатазы протопорфирия Richard e a., 2004

возможности:

полностью инактивировать строго определенные гены в организме (нокаут генов),

2) вводить

в гены небольшие направленные мутации и/или осуществлять коррекцию мутантных аллелей (нокин генов).

Соотношение гомологичной рекомбинации к негомологичной варьирует в диапазоне 10-3-10-5

Таргетинг генов

мифическое чудовище, имеющее голову льва, туловище козы и хвост дракона]

— организм, состоящий из генетически неоднородных органов, тканей или клеток, которые происходят более, чем от одной оплодотворенной яйцеклетки. Термин «химера» применим к животному, полученному путем искусственного слияния эмбриональных клеток двух или более организмов, или к растению, у которого после прививки в месте срастания закладываются почки, в которых часть тканей принадлежит привою, а часть подвою. Впервые термин “Х.” применил Г. Винклер (1907 г.) для форм растений, полученных в результате сращивания паслёна и томата.

Используя две клеточные популяции, можно проследить в онтогенезе

за:

- происхождением и судьбой тканей,
- родословными клеток (Экспериментальная эмбриология)
как генетически различные клетки, сотрудничают и взаимодействуют между собой, создавая взрослое существо (Генетика развития).
роль отдельных генов (генный нокаут) (Молекулярная генетика)

гена и селекция
Инъекция таргетированных ЭСК в хозяйский эмбрион

Перенос бластоцисты приемной

матери

Получение бластоцисты

Выделение клеток внутренней клеточной массы

Х

Культивирование ЭСК

Схема получения трансгенных мышей с таргетированным геном

Химера

Донор

3 4 5

6 7 8 9

neo

Селекция: Hprt- - резистентность к 6-тиогуанину, Neo+ - резистентность к G418

Нокаут гена

выживают в присутствии G-418 и ганцикловира
Клетки, в которых не прошла

гомологичная рекомбинация, выживают в присутствии G-418 и гибнут в присутствии ганцикловира

Вектор

Вектор

Хромосома

Хромосома

система)
Lox P
Гомологичная рекомбинация
Вырезание гена
+ Cre
Ген
Белок отсутствует
Мышь №1
Мышь №2 с рекомбиназой

Cre и тканеспецифическим промотором

селективной среде HAT
loxP
loxP
Полноценный ген hprt

Academy of Sciences
Клетки с мутантной мтДНК
Клетки без мтДНК
Cинаптосомы
Цибрид
Цитопласт
Цитопласт
ЭСК, без

митохондрий (родамин)

Цибрид

Стратегии получения трансмитохондриальных мышей

Цибрид

Трансмитохондриальные мыши

Энуклеация

Яйцеклетка

Эпителий молочной железы

Микропипетка

Разделение клеток Выращивание в культуре

Индукция фазы G0

Культивирование

Удаление ядра

Ядро

Имплантация

Слияние и активация

«Суррогатная» мать

Клонированная овца

матери
Трансгенный клон коровы 1
Перенос гена в культуру
Селекция
Энуклеирование клетки
Развитие эмбриона
Перенос

трансгенного ядра в энуклеированный ооцит

Трансген

Автор

Кролик -гликозидаза Van den Hout e a., 2000
Овца фактор IX Schnieke et al., 1999

альфа1-антитрипсин McCreath et al., 2000

Свинья комплемент CD59 Imaizumi et al., 2000
N-ацетилглюкозоамин- Fujimura et al., 2004
трансфераза III

Коза антитромбин Baguisi et al., 1999
Коза моноклональные АТ Biotherapeuticus
Коза белок шолка паука Biotherapeuticus

genes in transgenic mice accelerated lymphomas
________________________________________________________________________
Transgene

Function Type of lymphoma References
(promoter-gene) of protein
________________________________________________________________________

Em-c-myc Transcription factor, B cell Adams et al., 1985
multifunctional oncoprotein
CD2-c-my Transcription factor, T-cell Webster et al., 1997
multifunctional oncoprotein
Em-N-myc Transcription factor, B cell Sheppard et al., 1998
apoptosis
lck-bcl2 Oncoprotein blocking T cell Linette et al., 1995
vav-bcl2 Oncoprotein blocking B cell, FL Egle et al., 2003
lck-bax Protein promoting apoptosis B cell Luke et al., 2003
MMTV-N-ras Transmembrane oncoprotein B cells Mangues et al., 1996
Em-pim1 Serine/threonine kinase T cell Breuer et al., 1989b

Моделирование заболеваний человека с помощью разных вариантов трансгеноза

Выявление генов, участвующих в лимфомогенезе, с помощью традиционных трансгенных мышей

by transgenic cross (double transgenic

mice).

 

Transgene Synergistic gene Type of lymphoma References
____________________________________________________________________
c-myc v-abl Pre-B cell Adams,Cory, 1991
c-myc pim1 Pre-B cell Verbeek et al., 1991
c-myc pim2 T cell Allen et al., 1997
c-myc N-ras Pro-B, pre-B cell Adams, Cory, 1991
c-myc bcl2 B cell Marin et al., 1995
c-myc cbfa1 B cell Vaillant et al., 1999
c- myc EBNA-1 B cell Drotar et al., 2003
c-myc runx-2 T cell Cameron et al., 2003
c-myc cyclin D pre-B and B cells Lovec et al., 1994
c-myc CKIIa lymphocytic leukemia Seldin, Leder, 1995

Синергизм действия генов в лимфомогенезе, установленный с использованием двойных трансгенных мышей

lymphomas detected by proviral insertions
___________________________________________________________________________________
Transgene Synergistic gene

Type of lymphoma _______________________________________________________________________

c-myc bmi1, pim1 Pre-B cell
c-myc p53 B-cell
c-myc til1 T cell
c-myc v-myb T cell
c-myc runx1 T cell
c-myc runx2 T cell
c-myc frat1 T cell
c-myc bmi1, gfi1 T cell
c-myc notch1 T cell
c-myc syndecan4 T cell

Синергизм действия генов в лимфомогенезе, установленный с помощью инсерций провирусов в геном трансгенных мышей

Type of References
gene

lymphoma

p53 Transcriptional factor В and T cell Ward et al., 1999
E2A Transcriptional factor T cell Yan et al., 1997
N-ras Small GTPase T cell Diaz et al., 2002
RARalpha Retinoic acid receptor В and T cell Haidar et al., 2000
pms2 DNA mismatch repair T cell Qin et al., 1999
snf5 Transcriptional factor T cell Roberts et al., 2002
PTEN Lipid phosphatase T cell Suzuki et., 2001
atm Phosphatidylinositol 3-kinase T cell Xu et al., 1996
msh2 Mismatch repair protein T cell Zhang et al., 2002
msh6 Mismatch repair protein T cell de Wind et al., 1999
53BR1 p53 binding protein T cell Ward et al., 2003
IFN-gamma Interferon gamma, cytokine B cell Street et al., 2002

Выявление генов, препятствующих лимфомогенезу, с помощью генного нокаута

ex vivo
Размножение клеток in vitro
Терапевтический ген
Терапевтический ген
Генная терапия

некоторых заболеваний человека

Заболевание Вектор Ген

Болезнь Паркинсона RV декарбоксилаза глутаминовой ы кислоты
Гемофилия AAV фактор IX
Грануломатоз RV GP91
Острый иммунодефицит RV рецептор интерлейкина 2
Дефицит орнитинтранскарбамилазы Ad cDNA OTC
Врождённый амавроз Лебера RV RPE65
Ишемия нижних конечностей Ad ангиогенин, VEGF

онколитическими вирусами
Вирусы
Клетки с вирусами
Опухоль
Опухоль
Вирус болезни Ньюкасла, рекомбинантные аденовирусы, реовирусы, вирус

простого герпеса

(фермент тимидинкиназы вируса простого герпеса, HSV-tk)

с помощью:

1) Антисмысловых РНК

2)

Рибозимов

3) РНК- и ДНК-аптамеров

4) Белковых аптамеров

5) РНК-интерференции

6) Нокаута гена

систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении)
Комбинаторная библиотека олигонуклеотидов
(1015)
Обогащенная фракция
Связывание
Несвязавшиеся молекулы

(отбрасываются)

Связавшиеся молекулы

Элюция

ПЦР

Колонка с «пришитым» белком-мишенью

Несколько
циклов

Схема получения ДНК-аптамеров

некоторых заболеваний человека

Заболевание Вектор Ген

Болезнь Паркинсона RV декарбоксилаза глутаминовой ы кислоты
Гемофилия AAV фактор IX
Грануломатоз RV GP91
Острый иммунодефицит RV рецептор интерлейкина 2
Дефицит орнитинтранскарбамилазы Ad cDNA OTC
Врождённый амавроз Лебера RV RPE65
Ишемия нижних конечностей Ad ангиогенин, VEGF

стволовые клетки, экспрессиирующие VEGF и L1CAM, – при боковом амиотрофическом

склерозе
Мезенхимные стволовые клетки, экспрессирующие сурвивин, - при инсульте
Гематопоэтические стволовые клетки, экспрессирующие аденозиндеаминазу, - при остром комбинированном иммунодефиците