ВЗАЄМОДІЯ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. МЕТОДИ ЇЇ ВИЗНАЧЕННЯ

силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування,

що діють між активним центром АТ і епітопом АГ. Афінність відображає здатність антитіл формувати стабільні імунні комплекси.

[ АТ ] [АГАТ

] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ1 - константа швидкості асоціації; κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V1 = k1 ·[АГ] · [АТ] V2= k2 · [АГАТ] За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати: k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ] Константа афінності (2)

=

=

, М-1 або л/моль

Ka>108M-1 -високоспецифічне зв′язування;
Ka

- R T ln Ka, де R- газова постійна;T- абсолютна температура (Кельвін); Δ F - зміна вільної енергії взаємодії АГ-АТ.

[ АТ ] [АГАТ

] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ1 - константа швидкості асоціації; κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V1 = k1 ·[АГ] · [АТ] V2= k2 · [АГАТ] За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати: k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ] Константа афінності (2)

=

=

, М-1 або л/моль

балансу
[АТ]з = [АТ] +[ АГ·АТ ]

[АГ]з = [АГ] +[ АГ·АТ ] (3),

де [АТ]з і [АГ]з- загальна концентрація
АТ і АГ,
[ АГ·АТ ] - концентрація зв’язаних АТ чи АГ,
[АТ] і [АГ]- концентрація вільних АТ чи АГ, одержуємо (4)
[ АГ·АТ ] = ка [АТ]з [АГ] / 1+ ка [АГ]

За умови - [АГ]з >> [АТ]з , отримуємо (5)
[ АГ·АТ ]=
ка [АТ]з [АГ]з / 1+ ка [АГ]з - аналог рівняння Міхаеліса-Ментен;
при високих концентраціях [АГ]з
[АГ·АТ] = [АТ]з – концентрація комплексу спрямована до загальної концентрації антитіл (графік).

якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ]

= [АТ]з /2 . Враховуючи (3) і (4), отримуємо (6): [АГ]з'=1/ ка +[АТ]з/2

n - кількість центрів зв'язування антитіл
[АГ·АТ] /

[АГ]= ка [АТ]з - ка[АГ·АТ] =
= ка([АТ]з-[АГ·АТ]) - згідно з рівняннями 1, 2, 5

при цьому утворюються, ідентифікують візуально або за допомогою простих оптичних

приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами (пряма гемаглютинація).
Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це - методи пасивної (непрямої) гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації.
Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних), для виявлення реакції антиген-антитіло. Це - імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз, імунохроматографічний аналіз і т.д.
Метод імуносенсорів та метод генного зондування (Fish method).

на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів (антитіл) під час утворення комплексу:

зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д.
Розділення вільного і зв'язаного антигену, яке відбувається з залученням методів фракційного осадження (центрифугування), рівноважного діалізу, гель-фільтрації.

/ F · (n –B)

співвідношеннях вмісту антигену і антитіл

(преципітату), називається точкою еквівалентності реакції. Мінімальні і максимальні значення співвідношень

АГ/АТ, в межах яких ще спостерігаються доступні оку осади, визначають як зону еквівалентності.

і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості. Реакції

преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації -реакція утворення осаду в реакції преципітації йде досить повільно, сам преципітат має нижчу щільність і може з часом дисоціювати.

зразка, які аналізують на присутність данного антигена

і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена

V. Schally

Rosalyn Yalow

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1977 was divided, one half jointly to Roger Guillemin and Andrew V. Schally "for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain" and the other half to Rosalyn Yalow "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones".

of constant amounts of antibody and labeled antigen

за зв’язування зі специфічними антитілами

крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл.

В — крива конкуренції зв'язування міченого антигену неміченим і визначення концентрації 'антигену X

- загальний рівень радіоактивно-міченого 125І-АГ, внесений в пробірку Естріол – стероїдний

гормон, різкі зміни рівня якого при вагітності можуть свідчити про порушення у розвитку плоду

РІА

и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена

(Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело

і субстрати
Кон’югати та їх створення

при фотометрії -тетраметилбензидин
( англ.TMB)
Лужна фосфатаза – субстрат при фотометрії

– паранітрофенілфосфат

Галактозидаза-субстрат при фотометрії –нітрофенілгалактозид

(стрепт)авідин + мічений біотин”
Система “ антиген +антитіло-біотин + мічений стептавідин”

методом гібридних антитіл. 1 етап - накопичення протеолітичних фрагментів. Антитіло

класу G: дія папаїну і пепсину.

створення гібридних антитіл.

to do the assay
Purified antigen (if you want to detect

or quantify antibody).
Purified antibody (if you want to detect or quantify antigen).
Standard solutions (positive and negative controls).
Sample to be tested.
Microtiter dishes: plastic trays with small wells in which the assay is done.
Wash fluid (buffer).
Enzyme-labeled antibody and enzyme substrate.
ELISA reader (spectrophotometer) for quantitative measurements.

варіант конкурентної ELISA

2 варіант цього ж методу

1













2

(EIA) is the first and most basic test to determine

if an individual is positive for a selected pathogen, such as HIV. The test is performed in a 8 cm x 12 cm plastic plate which contains an 8 x 12 matrix of 96 wells, each of which are about 1 cm high and 0.7 cm in diameter. The next page illustrates how an HIV ELISA is performed.

Plate ELISA

ELISA
plate

Patient serum which contains antibodies. If the patient

is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.

Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.

Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

as optical density at 450 nm. The cutoff value indicating

a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis

ELISA Activity
ELISA data from three patients

ELISA PLUS Kit панель А-приготування проб; панель В- власне ELISA

нм

за дії іонізуючої радіації:
1 - контроль; 2 - 1,0

Гр (30 хв після опромінення); 3 – 1,0 Гр (3 год після опромінення);4 – 7,78 Гр (30 хв після опромінення); 5 – 7,78 Гр (3 год після опромінення)

*- достовірно у відношенні до контролю, Р  0,05

А

Б

*

*

*

*

*

*

*

Апоптотичні клітини, %

Апоптотичні клітини, %

immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals

one control subject

present at either gp160 OR gp120PositiveBands present, but pattern does

not meet criteria for positivityIndeterminate

Band pattern Interpretation
Lane 1, HIV+ serum (positive control)
Lane 2, HIV- serum (negative control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C

виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Підсилення

процесу за рахунок окиснення перекисом водню люмінолу і деяких його похідних з залученням пероксидази чи каталази - хемілюмінісценція

2 варіанти
при аналізі по прямій схемі перексид водню окислює

люмінол
(+ пероксидаза);
по непрямій схемі- антиген мітиться хемілюмінесціюючою групою (люмінолом чи його похідними). Така мітка у вільному стані окислюється з виділенням світла. У разі утворення комплексу з антитілом, вона втрачає можливість окислюватись, отже світіння буде відсутнє. В цьому випадку інтенсивність сигналу пропорційна тій кількості мітки, якій антиген не дав зв’язатись з антитілом.

Насьогодні широко використовується метод посиленної хемілюмінесценції ECL- метод (Enhanced Chemiluminescence). В реакції пероксидаза хрону, коньюгована з вторинними антитілами, каталізує окиснення люмінолу до діаніону при додаванні перексиду водню , що пов’язано з емісією квантів світла. Чутливість реакції посилюється при додаванні фенольної похідної – кумарової кислоти. Візуалізація результатів відбувається з використанням рентгенівської плівки, з подальшим її проявленням.

візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів

be determined by the ELISPOT assay. The ELISPOT assay is

a variant of the ELISA assay in which antibodies bound to a plastic surface are used to capture cytokines secreted by individual T cells. Usually, cytokine specific antibodies are bound to the surface of a plastic tissue-culture well and the unbound antibodies are removed (top panel). Activated T cells are then added to the well and settle onto the antibody-coated surface (second panel). If a T cell is secreting the appropriate cytokine, this will then be captured by the antibody molecules on the plate surrounding the T cell (third panel). After a period of time the T cells are removed, and the presence of the specific cytokine is detected using an enzyme-labeled second antibody specific for the same cytokine. Where this binds, a colored reaction product can be formed (fourth panel). Each T cell that originally secreted cytokine gives rise to a single spot of color, hence the name of the assay. The results of such an ELISPOT assay for T cells secreting IFN-γ in response to different stimuli are shown in the last panel. In this example, T cells from a patient with melanoma were stimulated with the mitogen PHA (top left), a peptide from cytomegalovirus (top right), a peptide from a melanoma tumor associated antigen (lower left), and with no peptide (lower right). You can see the greater response to the cytomegalovirus peptide compared to the melanA peptide by the greater number of spots..