Полимеразная цепная реакция

репликацию

ДНК и позволяющий обнаружить

единственную специфическую молекулу ДНК

в

присутствии миллионов других молекул.

- как способ контроля за качеством объектов окружающей среды и

продуктов питания, криминалистика (идентификация личности и отцовства), клиническая медицина.

Диагностики инфекционных заболеваний 2. Исследования структуры природных микробных сообществ. 3. Оценки пищевой

продукции, полученной из генетически модифицированных источников, в частности выделение и очистка ДНК растений. 4. Расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК различных штаммов микроорганизмов с научной целью.

Этот метод поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту

- уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической и абиотической среде. Преимущество ПЦР-диагностики в том, что метод позволяет определить возбудителя заболевания, используя любой биологический материал, и вести диагностику инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания, то есть - это один из самых современных и надежных методов диагностики.

С.tracho-matis)
микоплазмоза птиц ( М.synoviae, M. gallsepticum)
туберкулеза ( М. bovis, M.

tuberculosis, M. avium)
сальмонеллеза
бруцеллеза
листериоза (Listeria monocytogenes)
ротавирусной инфекции
кампилобактериоза (C. jejuni)
токсоплазмоза

плотоядных животных
парвовирусного энтерита собак и норок и пан-лейкопении кошек
аденовируса плотоядных
грипп

животных и птиц с последующей идентифика-цией гемагглютинина 5 и 7 типов вируса гриппа А

скота и птиц
лептоспироза
бешенства и др.

Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)

окружающей среды чрезвычайно важно для оценки влияния этих изменений, особенно

имеющих антропогенное происхождение, на биоразнообразие, сохранение которого является важнейшей задачей человеческой цивилизации. Среди естественных компонентов биосферы значительное место занимают микроорганизмы. В силу высокой скорости эволюции микроорганизмы наиболее эффективно реагируют на изменение окружающей среды, так что исследование

оценить эффекты изменений окружающей среды на биоразнообразие.

Такие исследования приобретают в последние годы важное значение в связи с широким распространением генетически модифицированных микроорганизмов и практически бесконтрольным, а все чаще и направленным попаданием их в естественные микробные сообщества. Все эти воздействия могут создать проблемы, связанные с распространением

так называемым горизонтальным переносом генов, что неминуемо приведет к существенному

ускорению эволюции микробных сообществ, появлению новых форм с новыми генетическими признаками. Оценка устойчивости таких форм и содержащихся в них конструкций, а также последствий их появления в природе чрезвычайно важна для разработки стратегий последующего развития общества.

выделение и очистка ДНК растений
Предлагаемый микрометод выделения геномной ДНК

из растительного материала для RAPD- анализа является быстрым и экономичным, а также простым в исполнении. Растительный материал может быть взят как из поля, теплицы, так и выращен в лабораторных условиях. Данный микрометод не требует больших количеств растительной ткани (1-20 г), что является большим преимуществом в сравнении с другими методами, так как позволяет сохранить растение для дальнейшей работы.

кукурузы и идентификация генетически-модифицированной сои линии 40-3-2
Выявление генетически-модифицированных ингредиентов (сои

и кукурузы) в продуктах питания
Выявление фальсификации мясного сырья и продуктов( определение видовой принадлежности тканей жвачных животных в разных объектах, в том числе сухих животных кормах, одновременной идентификации тканей жвачных животных, свиней, сухопутной и водоплавающей птицы в мясном сырье, многокомпонентных мясных продуктах и животных кормах)

ДНК- матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция называется

репликацией ДНК

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: 1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);
2.Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);
3.Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей)

(ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент)
Олигонуклеотидные затравки (праймеры) Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента).
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК)
Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи, синтезируемой ДНК)
Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Мg2+, необходимые для поддержания активности фермента)

фрагмента ДНК амплификация включает несколько (20-40)циклов. Каждый цикл амплификации включает

3 этапа при различных температурных режимах
1 этап:
Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95°С в течение 30-40 сек.
2 этап:Присоединение праймеров (отжиг).
Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Времяотжига-10-40сек.
З этап: Достраивание цепей ДНК.
Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5т-конца к З'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического

фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n , где n- число циклов амплификации. Поэтому, если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Выделение ДНК (РНК) из клинического образца

- Амплификация специфических фрагментов ДНК

-

Детекция продуктов амплификации

специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление

белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК(РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.

фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. В

большинстве методик определения специфических фрагментов генома используется т.н. «классический вариант» направленной ПЦР. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используется метод «гнездной» (nested) ПЦР, в котором используются 2 пары праймеров ("внешние"-для 1 стадии, и "внутренние» для 2-ой стадии).

смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза

в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси или в агарозный гель добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле

наличия возбудителей Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры,

являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что является лишь опосредованным свидетельством наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. .

метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный,

характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов -1000-100000 клеток)

различных возбудителей
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя.

Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний

результата анализа Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры

возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4.5 часа.

только острых, но и латентных инфекций Особенно эффективен метод ПЦР для

диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

- возможностью контаминации..
Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ДНК

приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов. В процессе работы могут встретиться два вида контаминации:
1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов.
2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами). Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов..

реагентов для

выделения ДНК (РНК) из клинического материала;
высокоскоростная микроцентрифуга (10-12 тыс.об/мин);
твердотельный термостат поддерживающий температуру до 99°С;
встряхиватель для микропробирок (типа микроцентрифуги-вортекс)
комплект полуавтоматических микропипеток- дозаторов (5-40,40-200, 200-1 ОООмкл);*
водоструйный или вакуумный насос с колбой-ловушкой*.
(*- при использовании комплекта реагентов "ДНК-ЭКСПРЕСС" данные позиции не используются)

ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ

ПЦР (амплификации);
комплект микропипеток-дозаторов (0.5-10 (2шт), 5-40,40-200, 200-ЮООмкл);
программируемый термостат (амплификатор);
микроцентрифуга-вортекс;
ПЦР-бокс (PCR-Workstation).

электрофореза;
• СВЧ-печь или водяная баня на 95-100°С; •комплект микропипеток-дозаторов (5-40, 200-ЮООмкл); ультрафиолетовый

трансилюминатор; •видеосистема для регистрации гелей,
•комплект реагентов для электрофоретической детекции: агароза; 50-кратный ТАЕ-буфер для элек трофореза (2М Трис-ацетат (рН=8.2, 0.05М ЭДТА); раствор бромистого этидия, 1%.

материалов: Стерильные пластиковые микропробирки объемом 1.5 мл для взятия биоматериала; Стерильные пластиковые

микропробирки объемом 0.5 мл для амплификации; Стерильные пластиковые наконечники к микропипеткам; Стерильные наконечники с фильтрами к микропипеткам; Штативы для микропробирок;

объеме через фильтр из ультратонких волокон. Воздух, проходя через фильтр,

очищается от аэрогенных загрязнений и, благодаря специальной конструкции фильтра, подается в рабочую зону однонаправ­ленным ниспадающим (вертикальным) потоком. Часть нагнетаемого вентилятором в камеру стати­ческого давления воздуха (15%) через НЕРА - фильтр выбрасывается в помещение. Из-за иску­сственно созданного разряжения происходит подсос воздуха в рабочую камеру на величину (-100 мм) передней перфорации рабочих столешниц. Благодаря этому устанавливается воздушная завеса, предотвращающая перекрестную контаминацию "рабочий агент-оператор". Внутренняя поверхность НЕРА - фильтров, а также весь рециркулируемый и выбрасываемый в помещение воздух обеззара­живаются лампой УФО.

Конструкция и размеры позволяют разместить в боксе амплификатор, микроцентрифугу, штатив с автоматическими пипетками и другое оборудование. Внутри бокса предусмотрены две закрывающиеся розетки, установлены две лампы: для обработки рабочей зоны - бактерицидная 30W с таймером, для освещения - лампа дневного света ЛД-ЗОВт.