днк-диагностика

диагностики и лечения различных заболеваний, в т.ч. наследственных, создания лекарственных

препаратов, создания генетического материала, идентификации личности.

лизис клеток,
2. удаление органелл,
3. разрушение белков специфическими протеазами,

4. ДНК экстрагируется из растворов
5. ДНК растворяется в буферном растворе.
6. ДНК фрагментируется.

8. определение первичной структуры ДНК.

клеток.

из 8 – 12 нуклеотидов в 2- х цепочечной молекуле

ДНК и разрезают её в местах локализации этих последовательностей.

5’

3’

3’ 5’

Действие рестриктаз 1 –го типа, образование слепых концов

 

5’

3’

3’ 5’

меченными ДНК - зондами.
ДНК – зонд используется

для специфического связывания исследуемых участков генов.

от 15- 20 до 100 и выше 100 нуклеотидных звеньев

со строго определённой первичной структурой.

соответственно РНК и белков.

рестриктазных реакций фрагменты ДНК подвергаются денатурации и перносятся на плотный

носитель чаще всего на нитроцеллюлозный фильтр.
(Процесс переноса - блоттинг).

Блоттинг за счёт капиллярных сил, электрического поля или вакуума.

положения искомого участка ДНК.

в гене В – цепи гемоглобина триплета ГАГ на ГТГ,

при этом в ходе трансляции вместо остатка глутаминовой кислоты в 6 - м положении В – цепи встраивается валин (B6 Глу Вал).

– глобину

АА

AS SS
 

и в каждую добавляется следующие компоненты:

1. денатурированная однонитевая ДНК;
2. ДНК

– полимераза;
3. дНТФ: дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ;
+
1     Один из терминаторов - дидезоксинуклеозидтрифосфат: ддАТФ, ддЦТФ, ддГТФ, ддТТФ
.

амплификация.
1. фрагментирование 2- х молекул ДНК, полученных

из разных источников с образованием липких концов.

2. процедура – отжига, что приводит к образованию рекомбинантов, соединённых за счёт липких концов

3.сшивка липких концов ДНК – лигазой – с образованием рекомбинантной ДНК.

встраивание нужного нам фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (вектор).

Вектор обеспечивает проникновение ДНК в бактериальные клетки, плазмиды, фаги, ретро – и аденовирусы.

При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий введённого в плазмиду фрагмента ДНК.

тотальной ДНК клеточной линии или ткани.

Для конструирования геномной библиотеки

используются фаговые векторы, т.к. они позволяют клонировать протяжённые фрагменты ДНК.
 

исчерпывающих генетическихОсновной задачей программы является построение исчерпывающих генетических и физических

карт большого разрешения каждой из 24 хромосом человека и определение полной первичной структуры ДНК этих хромосом.

на индивидуальных хромосомах.

Генетические карты сцепления правильно отражают порядок расположения

генетических маркеров на хромосомах,

Единицей измерения расстояний при генетическом картировании является один сантиморган (сМ), т.е. такое расстояние, при котором вероятность рекомбинации между генами равно 1%.

парах оснований.

vitro участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен

пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК.

содержащие антигены различных инфекционных возбудителей (например: вирусные гепатиты, ИППП: герпес,,

трихомониоз, хламидиоз и др.).

Выявление онкомаркёров,

ПЦР используется для выявления наследственной патологии, идентификации личности, установления отцовства,

картирования генома.

с исследуемым образцом запускается 25 – 30 циклов ПЦР, в

ходе которых число синтезированных копий ДНК достигает несколько миллионов.

праймерами – олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями длиной от 15 до 30 пар

нуклеотидов, которые будут комплементарны 3’ – концам пар нуклеотидов.

ПЦР протекает в буферном растворе, содержащим ионы магния.

1.    Плавление
2.     Гибридизация ДНК с праймерами
3.    

Элонгация термостабильной ДНК - полимеразой

НАГРЕВАНИЕ, ОТЖИГ
ЦЕПЬ 1 3’
ПРАЙМЕР
ПРАЙМЕР
ЦЕПЬ 2 5’

ЭЛОНГАЦИЯ ЦЕПЕЙ

ЦЕПЬ 1 3’
  5 ’
  5’


 
 


 
ЦЕПЬ 2 5’
 










ЦЕПЬ 1 3’


5’
5’





ЦЕПЬ 2 5’

УЧАСТОК ДНК

УЧАСТОК ДНК

ЦЕПЬ 1 3’
 
 
 
 
  ЦЕПЬ 2 5’

 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ЦЕПЬ 2

5’
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Genotyper-tm

позволяет автоматически соотносить

информацию о интенсивности флюоресценции продуктов PCR с имеющейся информацией об изученных локусах.

Метод ПЦР позволяет создавать гибридные карты генома

рестрикционных фрагментов.

∙        гемофилия А, талассемия, ретинобластома и гранулематоз

∙        контроль проявленности

генов у потомства гетерозиготных родителей по различным генам, например по гену серповидно – клеточной анемии и др. нарушений.

∙        Идентификация делеции в гене белка дистрофина (миодистрофия Дюшена)

рестриктаз.

этапа:

1    1. Выделение геномной ДНК

    2. Рестрикция геномной ДНК специфической

рестриктазой

    3. Электрофоретическое разделение образующихся фрагментов с последующей идентификацией путём блотт – гибридизации по Саузерну.

фрагмента ДНК с образованием более крупного фрагмента

присутствовать фрагмент равный расстоянию между полиморфным участком рестрикции и одним

из ближайших постоянных участков рестрикции.

можно лечить путём заместительной терапии.

Принцип метода заключается в клонировании гена

в векторе, способном включится в геном клетки – хозяина.
Ген переносится в соматические клетки и потомкам не передаётся.

животных, на которых исследуют экспрессию конкретных генов.