Ферменты

катализа. Специфичность
Природа катализа, теории ферментативного катализа
Классификация и номенклатура ферментов
Строение ферментов

(активный и аллостерический центры)
Коферменты и кофакторы. Роль витаминов
Кинетика ферментативных реакций
Ингибирование ферментативных реакций
Регуляция активности ферментов
Принципы энзимодиагностики
Применение ферментов в медицине

Хеопса рабочих кормили дрожжевым хлебом и пивом.

вкусов, ароматов и текстуры
Сохранение пищи с помощью молочной кислоты,

алкоголя, уксусной кислоты и щелочного брожения
Биологическое обогащение пищи аминокислотами, жирными кислотами и витаминами
Детоксификация пищи в процессе брожения
Уменьшение времени и затрат на приготовление пищи

января 1580-30 декабря 1644)) голландский химик, физиолог, врач и теософ-мистик

близко подошёл к современному пониманию роли ферментов при пищеварении.

живые микроорганизмы. «Неорганизованными ферментами» (от греческого ἐν- в- и ζύμη –

дрожжи, закваска) называли секретируемый клетками сок

Луи Пастер (12 декабря 1822 – 28 сентября 1895)

Юстус Либих (1803—1873)

смерти Л. Пастера в 1897 г. Э.Бухнер опубликовал работу «Спиртовое

брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение так же, как и неразрушенные дрожжевые клетки. В 1907 за эту работу он был удостоен Нобелевской премии.

Джеймс Бетчеллер Самнер (James Batcheller Sumner) (19 ноября 1887 –

12 августа 1955) - американский биохимик.
В 1930 г. Джон Нортроп получил кристаллический пепсин
В 1931 г. Нортроп и Кунитц получили кристаллический трипсин
В течение последующих 10 лет было выделено еще несколько ферментов, и белковая природа ферментов была окончательно доказана
В 1969 г. В лаборатории Б. Меррифилда был синтезирован первый фермент – рибонуклеаза, состоящая из 124 аминокислот. Искусственно синтезированный фермент не отличался от природной нуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тестам

Чек (Thomas Robert Cech; 8 декабря 1947 г) - американский

молекулярный биолог.
Удостоен Нобелевской премии (совместно с Сидни Олтменом) («for discovery of catalytic properties of RNA») в 1989 г.

но сами при этом не расходуются.
Ферменты, или энзимы, -

это биологические катализаторы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах.
По своему химическому строению почти все ферменты являются белками.
Каталитически активные рибонуклеиновые кислоты называются рибозимами

состав конечных продуктов реакции и не тратятся в процессе катализа,

выходят из реакции в неизменном виде.
2) ускоряют реакции, не противоречащие законам термодинамики.
3) не смещают положение равновесия, а лишь ускоряют его достижение.

обладают узкой избирательностью – специфичностью, действия на субстраты.
3) Ферментативные

процессы не дают побочных реакций, для них характерен 100% выход продукта.
4) Ферменты катализируют реакции в мягких условиях: при обычном давлении, небольшой температуре и значениях рН, близких к нейтральным.
5) Активность ферментов регулируется – они могут изменять свою скорость под воздействием ряда факторов, обеспечивая скоординированность всех метаболических процессов во времени.

или несколькими определенными субстратами
Различают:
абсолютную специфичность (глюкокиназа)
относительную (или групповую) специфичность

(пепсин)
cтереохимическую специфичность: например, глюкозооксидаза окисляет только β-D-глюкозу

→ [EР] → E + P

Стадии ферментативной реакции:
Сближение фермента

и субстрата: E + S
Стабилизация переходного состояния: [ES]
Каталитическая реакция – превращение субстрата в продукт реакции –
[EР] → E + P

равновесия за счет снижения энергии активации (Еа), часто ступенчато.

энергией активации Еа
В переходном состоянии [ES] происходит перераспределение химических

связей и образование продуктов реакции.
Природа ферментативного катализа состоит в том, что ферменты с термодинамической точки зрения ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации.
Энергия активации – это та минимальная энергия, которая необходима для того, чтобы произошла химическая реакция, т.е. энергетический барьер преодолевают молекулы, обладающие энергией активации

структуры активного центра фермента, вызванныесубстратом, согласно модели «индуцированного соответствия» Д.

Кошланда. Доказано рентгеноструктурным анализом, ЭПР и ЯМР

6-летней работы Комиссии по ферментам
Оксидоредуктазы
Трансферазы
Гидролазы
Лиазы
Изомеразы
Лигазы

название:
название субстратов (через двоеточие), название типа химического превращения и

окончания -аза). Например, лактатдегидрогеназа будет иметь систематическое название «L-лактат:NAD+ оксидоредуктаза»

На практике используют рабочие названия ферментов, которые состоят из названия субстрата, типа реакции и окончания «-аза». Например: ЛАКТАТ + ДЕГИДРОГЕНизация + АЗА = ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА.

Некоторые ферменты сохранили исторически сложившиеся тривиальные названия, например УРЕАЗА, ПЕПСИН

молочной кислоты (лактат) в пировиноградную (пируват) и наоборот:

СН3СН(ОН)СООН + NAD+

↔ CH3COCООH + NADH + H+

2.3.1.6, (систематическое название
ацетил-КоА: холин О-ацетилтрансфераза)

СH3CO-S-KoA + HO-СН2-СН2-N+(CН3)3 → КоА-SH

+ СН3СОO-СН2-СН2-N+(CН3)3

воды
Дипептидаза расщепляет дипептид на две аминокислоты при участии воды:

H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R')-COOH

+ H2O→H2N-CH(R)-COOH + NH2-CH(R')-COOH

разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления):
Пируватдекарбоксилаза (ЕС

4.1.1.1, 2-кетокислоты карбокси-лиаза):
CH3COCООH → CH3COH + СО2

изменением строения внутри одной молекулы
Глюкозо-6-фосфат-изомераза (ЕС 5.3.1.9, D-глюкозо-6-фосфат кето-изомераза) :

L-аспартат: аммиак-лигаза синтезирует аспарагин из аспарагиновой кислоты и аммиака:

имеет свой определенный код, состоящий из четырех цифр, разделенных точками.

Первая цифра обозначает класс фермента, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая означает номер фермента.

на CH-OH группы донора
EC 1.2 Действующие на альдегидные или оксо-

группы донора
EC 1.3 Действующие на CH-СH группы донора
EC 1.4 Действующие на CH-NH2 группы донора
EC 1.5 Действующие на CH-NH группы донора

Фермент Лактатдегидрогеназа (LDH, EC 1.1.1.27) – это оксидоредуктаза окисляет гидроксильную группу в молекуле лактата, поэтому относится к 1 подклассу:

СН3СН(ОН)СООН + NAD+ → CH3COCООH + NADH + H+

1.1.1 Акцептор NAD или NADP
EC 1.1.2 Акцептор- цитохром
EC 1.1.3 Акцептор-

кислород
EC 1.1.4 Акцептор- сульфид
EC 1.1.5 Акцептор- хинон или подобная группировка
Коферментом Лактатдегидрогеназы (LDH, EC 1.1.1.27) является НАД, поэтому этот фермент относится к 1 подподклассу:

СН3СН(ОН)СООН + NAD+ → CH3COCООH + NADH + H+

фермента:
EC 1.1.1.1 alcohol dehydrogenase
EC 1.1.1.2 alcohol dehydrogenase (NADP+)
EC 1.1.1.3 homoserine

dehydrogenase
EC 1.1.1.4 (R,R)-butanediol dehydrogenase
... и т. д.
У Лактатдегидрогеназы (LDH, EC 1.1.1.27) 27 порядковый номер в ряду ферментов 1 подподкласса


СН3СН(ОН)СООН + NAD+ → CH3COCООH + NADH + H+

Активный центр располагается в углублении (в нише) третичной конформации поверхности

фермента






Рис. Субстрат-связывающий карман в сериновых протеазах.

которой осуществляется его каталитическое действие.
В активном центре

выделяют 2 домена: «контактный», в котором происходит связывание и ориентация субстрата, и «каталитический», в котором происходит химическое превращение субстрата
Эти 2 домена могут перекрываться
У простых белков-ферментов активный центр образован радикалами аминокислот
У сложных белков-ферментов в активном центре находятся коферменты или кофакторы

его комплекса с ферментом.
В Каталитическом домене происходит химическое превращение

субстрата
Молекула субстрата также содержит функционально различные участки, подвергающиеся атаке со стороны фермента.

взаимодействия, а также координационные связи

Информация о природе связей между субстратом

и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами УФ- и ИК-спектроскопии

выделены Ser195 (оранжевый), His57 (синий) и Asp102 (малиновый), в субстрат-связывающем

домене зеленым изображены NH-группы, образующие оксианионовую дыру, голубым  —  неспецифическая субстрат-связывающая площадка, и желтым - группы, выстилающие специфический субстрат- связывающий карман.

Гидрофобные и ионные взаимодействия

водородные взаимодействия

от активного центра, специальный регуляторный центр фермента, с которым связываются

низкомолекулярные вещества – эффекторы, молекулы которых отличаются по структуре от субстратов.

Положительный эффектор ускоряет реакцию
Отрицательный эффектор замедляет реакцию

Ферменты, имеющие аллостерический центр, получили название аллостерических ферментов.

и интегрировании биохимических реакций.
Менее активная конформация называется Т-cостояние (от

английского tense – напряженное), а более активная – R-состояние (от английского relaxed – расслабленное).

называется КОФЕРМЕНТОМ или кофактором
Если КОФЕРМЕНТ прочно связан с апоферментом, его

называют ПРОСТЕТИЧЕСКОЙ ГРУППОй
Природный комплекс апофермента с кофактором составляет ХОЛОФЕРМЕНТ, т. е. функционально действенный энзим. Соединение в ХОЛОФЕРМЕНТ осуществляется любыми типами связей, кроме ковалентных.
Апофермент синтезируется в организме
Большинство коферментов – это производные витаминов или содержат витамин в качестве компонента

которых фермент не активен
Кофакторы - ионы некоторых металлов (Mg, Zn,

Fe, Сu, Со, Mo и др.), прочно связанные с активным центром
Роль кофакторов – улучшение образования [ES]-комплекса, ориентация субстрата, стабилизация как субстрата, так и активного центра фермента

апофермента
Апофермент усиливает каталитическую активность небелковой части (КФ и ПГ). Например,

NAD+ является КФ многих дегидрогеназ, отличие - в апоферментной части.

простетической группой цитохромов, каталазы, пероксидазы
Производные Нуклеотидов – доноры и акцепторы

протона (Н+) – НАД, НАДН
Убихинон, или коQ
ФАФС – фосфоаденозилфосфосульфат донор сульфата
SAM – S-аденозилметионин донор метильной группы
Глутатион

типа; встречаются у организмов одного вида (или в одной ткани).

И. катализируют одну и ту же реакцию, но различаются аминокислотным составом, некоторыми физическими, иммунологическими и каталитическими
Лактатдегидрогеназа имеет 5 изоформ; каждая форма (тетрамер) построена из 4 белковых субъединиц двух типов.

изучает зависимость скорости реакции от химической природы реагирующих веществ и

от факторов окружающей среды
Скорость ферментативной реакции определяется изменением количества молекул субстрата или продукта за единицу времени
Кинетика ферментативных реакций определяется образованием фермент-субстратного комплекса:
E + S ⇆ [ES] → [ES] → E + P

международных единицах (МЕ):
1 кат – это количество фермента, которое

превращает в продукт 1 моль субстрата за 1 сек
МЕ фермента – это количество фермента, которое превращает в продукт 1 мкмоль субстрата за 1 мин
1 кат = 6 ∙ 107 МЕ или 1МЕ = 16,67 нкат

Удельная активность фермента – это количество единиц активности фермента в образце ткани, деленное на массу белка в этой ткани

пригодным для практического применения.
Наиболее удобной оказалась модель ферментативной реакции

первого порядка (один субстрат), разработанная в 1913 году немецким химиком Леонором Михаэлисом (1875-1949) и канадским патологом Мо Ментеном (1879-1960)
E + S ⇆ [ES] → [ES] → E + P

образования [ES]
k-1 – константа скорости обратной реакции
k2 –

константа скорости образования продукта реакции
Соотношение констант скоростей называют константой Михаэлиса Кm:
km = (k-1 + k2)/k1 Скорость реакции пропорциональна концентрации [ES]
А скорость образования [ES] зависит от концентрации [S] и концентрации [Е]
Наибольшая скорость реакции наблюдается, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом

(математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной

кинетике)

V = Vmax•[S]/(Km+[S])
В этом уравнении Vmax и Km постоянные величиныны, т.е. константы и не зависят от концентрации субстрата – они являются кинетическими характеристиками эффективности фермента
Vmax – дает характеристику каталитической активности фермента, имеет размерность моль/л и определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата

Km – характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является постоянной величиной.
Km равна концентрации фермента при половине максимальной скорости (Vmax)

Константа Михаэлиса измеряется в моль/л и бывает от 10-2 до 10-7, чем меньше Кm, тем активнее фермент.

аллостерических ферментов имеет сигмоидный характер

Vmax•[S]/km = k •[S], т.е. при очень низких [S]
скорость

прямо пропорциональна концентрации субстрата
При [S] = km
V = Vmax•[S]/(•[S]+[S]) = Vmax/2, т.е. km равна
концентрации субстрата при половине
максимальной скорости
При [S] > > km V = Vmax•[S]/(Km+[S]) = Vmax•[S]/[S] = Vmax, т.е.
при очень высоких [S] скорость является
максимальной и не зависит от [S]

и БЭРК приравняли обратные зависимости левой и правой частей уравнения.

Это уравнение прямой линии: у = ах + b
Графическое выражение для скорости реакции в координатах Лайнуивера-Бэрка имеет вид прямой линии, отсекающей на оси Х значение -1/Km, а на оси Y- значение 1/V max:

ускоряется скорость реакции при повышении температуры на 100С

При 1000С почти

все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляют, очевидно, только один фермент мышечной ткани - миокиназа, которая выдерживает нагревание до 1000С), так как происходит денатурация белка

При низких температурах (00С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля (снижается кинетическая энергия - ЕА).

На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.

отсутствие зарядов, т.е. степень ионизации, влияет на образование фермент-субстратного комплекса,

на способность фермента к связыванию субстрата.

пределах физиологических значений. Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2.0.

Влияние изменений рН среды на молекулы фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина и др.).

При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или в неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно формировании активного фермент-субстратного комплекса.
-СООН АСП или ГЛУ при рН<7 будет нейтральной, а при рН>7 имеет «-» заряд
-NH2 АРГ, ГИС, ЛИЗ при рН<7 будет имеет «+» заряд, а при рН>7 будет нейтральной

Кроме того, имеет значение и состояние ионизации субстратов и кофакторов.

(кислоты, щелочи, соли тяжелыхи металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации

фермента.
Необратимое ингибирование неспецифично, оно не связано с механизмами действия ферментов
С необратимым ингибированием связано действие многих токсинов и ядов на организм.

на основе уравнения Михаэлиса-Ментен.
Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют

на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

собой за место в активном центре, стремясь вытеснить один другого

из фермент-субстратного комплекса.
Действие конкурентного ингибитора снимается высокими концентрациями субстрата, при этом Vmax не изменяется, а Кm, увеличивается

конкурентного ингибитора
Vmax не изменяется, а Кm, увеличивается

субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в

другом месте молекулы фермента
Степень торможения определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент.
Неконкурентное ингибирование может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр.
Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента

конкурентного ингибитора
Vmax уменьшается, а Кm не изменяется

используют при лечении мышечной дистрофии (нейромедиатор ацетилхолин вызывает деполяризацию мембраны)
Сульфаниламиды

– аналоги пара-аминобензойной кислоты являются антиметаболитами
Аспирин ингибирует циклооксигеназу

модификация: фосфорилирование-дефосфорилирование – гликогенфосфорилаза (фосфорилированная форма активная, дефосфорилированная – неактивная
Ингибирование

– регуляция по принципу обратной связи: конечный продукт ингибирует ключевой фермент: холестерин – ГМГКоА-редуктазу
Репрессия или индукция генов (изменение биосинтеза ферментов): тироксин взаимодействует с гормончувствительным участком ДНК
Компартментализация: ЖК синтезируются в цитоплазме, окисляются в митохондриях (ЦПЭ)
Аллостерическая регуляция

клеток: АСТ, АЛТ – гепатит; КФК, АСТ, ЛДГ – инфаркт

миокарда
Количество высвобождаемых ферментов достаточно для его обнаружения: АСТ в норме 2-25 МЕ, при гепатитах – 150-1000 МЕ
Активность высвобождаемых ферментов стабильна
Органоспецифичность: ЩФ Регана при раке легких

диагностическое значение, так как эти ферменты обладают органоспецифичностью: АЛТ преобладает

в печени, а АСТ - в миокарде (в митохондриях).
Норма для АСТ до 40 МЕ, для АЛТ до 30 МЕ
При инфаркте миокарда активность АСТ в крови возрастает в ~8-10 раз, тогда как АЛТ только - в 1,5-2 раза.
При гепатитах активность АЛТ в сыворотке крови увеличивается в ~8-10 раз, а АСТ — в 2-4 раза по сравнению с нормой.
Коэффициент де Ритиса - соотношение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы ( АСТ/АЛТ). Значение коэффициента в норме составляет 1,33±0,42 или 0,91-1,75.
Коэффициенте де Ритиса меньше 1 говорит о поражении печени. При гепатитах коэффициент Ритиса снижается до 0,6. Однако при циррозе печени этот коэффициент увеличивается, что свидетельствует о некрозе клеток, при котором в кровь выходят обе формы ACT.
Коэффициент де Ритиса больше 2 свидетельствует о поражении сердца, и можно с уверенностью говорить об инфаркте миокарда или ином процессе, связанном с разрушением кардиомиоцитов.

панкреатин
При иммунодефицитах: вобэнзим
Протеолитические ферменты: трипсин, химотрипсин
При тромбозах: урокиназа, стрептолиаза
Для рассасывания

рубцов ( при ожогах): лидаза (гиалуронидаза)

Направления медицинской энзимологии:
Энзимопатология
Энзимодиагностика
Энзимотерапия
Направления инженерной энзимологии:
Создание синзимов – синтетических энзимов,

обладающих всеми свойствами ферментов, но лишенных побочных антигенных свойств
создание «гибридных» катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов.
создание биотехнологических реакторов, содержащих иммобилизованные ферменты или полиферментные комплексы, обеспечивающие производство ценных материалов для народного хозяйства и медицины