Флуоресцентная спектроскопия

самостоятельному свечению, которое возникает в результате различ-ных внешних воздействий.


Люминесценция (англ.

luminescence) –
- свечение.

Термин введен Видеманом в 1889 году.

= 10-9 - 10-6 с
Фосфоресценция
τ = 10-3 - 10-1

с

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
свечение, использует
энергию хим. реакций

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
способность живых организмов
светиться, достигаемая само-
стоятельно или с помощью
симбионтов.

природе и может происхо-
дить в газах, растворах и твёрдых телах.

Флуоресценция – испускание света молекулой-флуорофором (вторичный световой поток), возбуж-дённой световым излучением (первичный световой поток). Вторичный световой поток возникает при переходе молекул флуорофора из возбужденного электронного состояния (S1) в основное (So).

Флуоресценция прекращается сразу при исчезно-вении возбуждающего светового потока. (Затухание флуоресценции в этих условиях происходит в тече-нии наносекунд).

Как правило, флуорофором является карбо- или гетероциклическая

структура, которая поглощает квант светового потока с определённой энергией (определенной длины волны).
Количество энергии (длина волны) излучаемого света зависят от химической природы флуорофора и от параметров его окружения (вязкость, поляр-ность и др.).

состояниях при флуоресценции)
ЭНЕРГИЯ ЭЛЕКТРОНОВ





Основное состояние, So
S1, первое
возбужд.

состояние

S2, второе
возбужд.
состояние

+ hν

Потеря части энергии
за счет взаимостолкновений
молекул и атомов (вибрационная
релаксация), τ = 10-15 с

Излучаемые hν,
вторичное излучение
(вторичный световой поток)

Энергия излучаемых hν всегда
меньше энергии
возбуждающих hν − сдвиг Стокса

Испускание оставшейся
энергии в виде вторичного
светового излучения.
Длительность флуресценции
одной возбужденной молекулы
флуорофора, τ = 10-8 с

So

S2

S1

Fф
максимальна
λ возб.
λ флуор.
ФЭУ
Две лампы
для обеспечения полно-
диапазонного светового
потока в УФ

и видимой
областях спектра

Кювета с
образцом

Вторичное
излучение –
- флуоресценция

Измерение Fф

зависимость количества
поглощенного света от длины волны (то же, что
спектр

поглощения).
Спектр флуоресценции – интенсивность флуо-ресценции (Iф), измер. при различных длинах волн.

Е, Iф

Возб.

Возб.

Флуор.

Флуор.

сдвиг Стокса

Сдвиг Стокса – энергия кванта флуоресценции всегда меньше энергии кванта возбуждения –
- mах. флуоресценции сдвинут в
длинноволновую область

будет
флуоресцировать при любой длине волны возбуждаю-
щего света. Но, чем

дальше будем отклоняться от λ макс.
возбуждения, тем меньше будет интенсивность
флуоресценции.

существенно меняться при изменении концентрации раствора, его кислотности или щелочности

(рН), природы растворителя, температуры и ряда других факторов.

волны возбуждающего света.

2. Q (квантовый выход флуоресценции):

число квантов флуресценции
Q =
число поглощенных квантов

3. Закон Вавилова: Q не зависит от длины волны
возбуждающего света.

Q x C
Io – интенсивность возбуждающего света;
Q – квантовый выход;
С

– концентрация вещества

Флуоресцентный анализ на порядок чувствитель-
ней, чем спектрофотометрия.

концентрации (С) только в области малых концентраций (10-11 - 10-4

моль/л).
При увеличении концентрации раствора флуорофора линейность нарушается вследствие тушения флюоресценции (уменьшения ее интен-сивности). В таких условиях анализ сопряжен с большой погрешностью.

Классификация флуорофоров:
1. Биологические флуорофоры. Пиридиновые нукле-
отиды

(кофакторы), ароматические аминокислоты
в составе белков (90% флуоресценции обеспечива-
ется триптофаном), некоторые витамины (рибофла-
вин), аллофикоцианин, фикоционин, фикоэритро-
цианин, белок зелёной флуоресценции (green fluo-
rescent protein - GFP), клонирован из тропической
медузы, стал распространенным инструментом –
репортером (меткой) экспрессии интересующих
генов.
2. Флуоресцентные красители. Продукты органическо-
го синтеза: флуоресцеининизотиоцианат (ФИТЦ),
родамин, кумарин и пр.
Безусловно, все красители обладают хорошей во-
дорастворимостью, фотостабильностью и неток-
сичны для клеток.

применение в биологии – производные кумарина, флуоресцеина и родамина.

нано-
кристаллы). При уменьшении физических размеров
частиц

полупроводника до нанометровых ( 1-30 нм)
они начинают проявлять свойства, отличные от
объёмных полупроводников. В частности, речь идёт
о квантовых эффектах. При взаимодействии кванто-
вой точки с электромагнитныи излучением светового
диапазона образуется экситон (лат. excito — «возбу-
ждаю») . Экситон – водородоподобная квазичастица
(электрон и дырка). Рекомбинация экситонов (про-
цесс «гибели» электрон-дырочной пары в полупро-
воднике) приводит к высвобождению энергии.
Благодаря этому частицы нанометровых размеров,
образованные из таких полупроводниковых веществ,
как селенид кадмия (CdSe), способны поглощать свет
и фуоресцировать.

в зависимости от своих размеров, дают флуорес-
ценцию с разной длиной

волны при возбуждении одним
и тем же источником света.
Преимуществами квантовых точек над органическими
флуоресцентными красителями являются высокие
квантовые выходы флуоресценции и высокая устой-
чивость к фотообесцвечиванию. Т.о., для работы с
квантовыми точками не требуется особой аппаратуры,
можно обойтись обычным флуоресцентным микроско-
пом.

др.) токсичны для клеток. Для умень-шения токсичности применяется многоступенчатый
дизайн

квантовых точек. Полупроводниковое ядро
покрывается двойной защитной оболочкой из род-
ственного материала (для CdSe - сульфид цинка) и гидрофильной полимерной оболочки, которая увели-чивает растворимость квантовой точки в водной среде и даёт возможность химически привязывать к её поверхности другие молекулы.

разделить на две большие группы:

1. Флуоресцентные метки - служат

для идентифика-ции исследуемой молекулы или её пространственного положения. Метка должна быть химически стабильной и давать стабильную флуоресценцию, которая мало зависит от внешних факторов и минимально меняется во времени. Метка действует как пассивный «маяк», который сигнализирует о месте нахождения молекулы, к которой привязана. Наиболее распространёнными метками в современной клеточной и мол. биологии яв-
ляются флуоресцентные белки. Мечение белком зелё-ной флуоресценци является сегодня рутинной проце-дурой, используемой при изучении структуры и функций белков в различных модельных организмах.

со-стояниях: «выключенном» и «включённом». Эти состояния различаются между собой определёнными

параметрами флуоресцентной эмиссии (чаще всего квантовым выходом флуоресценции, позицией мак-симума в спектре эмиссии или временем жизни воз-буждённого состояния). Переход между состояниями «выключен» и «включён» зависит от наличия в среде тех молекул, которые зонд должен распознавать.

биомембране (оценка вязкости липидного бислоя)
300
400
500
λ, nm
Fλ/Fmax
excitation
emission
Спектры возбуждения и
флуресценции пирена
333
392

- мономер

470 - эксимер

Пирен в липидном бислое

Пирен свободно диффундирует в
толще липидного бислоя.
При увеличении «текучести» мемб-раны, чаще образуются эксимеры и F470 начинает преобладать над F392.

Образование эксимера
пирена из его мономеров

эксимер

излучаемая флуорофором энергия передается молекулам других веществ, находящимся в этом

же растворе: интенсивность флюоресценции снижается, вплоть до её полного подавления.
Для тушения требуется контакт между молекулами флуорофора и тушителя. При этом тушитель должен диффундировать к флуорофору в течение времени нахождения флуорофора в возбужденном состоянии.
В результате столкновения энергия возбуждения переходит в кинетическую энергию сталкивающихся частиц или в энергию возбуждения партнера. Эффективность тушения зависит от частоты столкновений, испытываемых возбужденным атомом.

С повышением температуры частота столкновений возбужденных атомов с другими частицами

возрастает, эффект тушения с ростом температуры также усилива-ется. В области комнатных температур выход флуорес-ценции обычно уменьшается на несколько %% с повы-шением температуры на 1 ºС.
2. Высокие концентрации - концентрационное туше-ние флюоресценции. Тушение проявляется при больших концентрациях частиц, когда длина свободного пробега мала, а частота столкновений, соответственно, велика. Тушение флуоресценции, вызванное столкновением молекул флурофора и тушителя, приводит к сокращению среднего времени жизни возбужденного состояния.

изменить рН раствора, что также
приводит к тушению

флуоресценции. Для большин-
ства флюоресцирующих веществ характерен свой
интервал значений рН раствора, при которых возникает
флюоресценция (рН-оптимум для флуоресценции).

график Штерна-Фольмера
Fo и F - интенсивность флуоресценции в отсутствии

и в присутствии тушителя (Q) соответственно; Q - тушитель (англ. quencher).

концентрация тушителя [Q]

1

2

3

Наклон графика = Кт (константа тушения флуоресценции)
1/Кт = концентрации тушителя, при
которой F0/F = 2, т.е. тушится 50%
интенсивности флуоресценции.

График линеен, если присутствует
один флуорофор. Если присутствуют
два типа флурофоров (с различной
доступностью для тушителя) – график
искривляется в сторону оси «Х».

высо-
кую чувствительность, свойственную флуориметрии,
необходимо:
возбуждать флуоресценцию при максимуме погло-

щения;
регистрировать флуоресценцию при длине волны,
при которой интенсивность флуоресценции макси-
мальна.


Для количественно анализа требуется калибровоч-
ный график (Fф от С) или стандарт (раствор флуоро-
фора с известной концентрацией).

том числе, в энзимологии).
2. Качественный анализ – спектры возбуждения и

флуресценции
уникальны.
3. Возможность работы с суспензиями живых клеток и субкле-
точных структур (мутность пробы не имеет значения).
Главное – избегать условий, при которых происходит тушение
флуоресценции.
4. С использованием флуоресцентных зондов и меток – можно
изучать структуру биомолекул (белков и нуклеиновых кислот),
свойства биомембран, оценивать трансмембранные потенци-
алы, активность транспортных и др. процессов и состояний в
различных живых системах.
5. В клинической биохимии – быстрый анализ содержания стеро-
идных горомонов, катехоламинов и порфиринов, выявлять
наличие биомаркёров многих заболеваний.
6. В хирургии на месте четко отграничивать интактную и патоло-
гически изменённую ткань (опухоль).