Разделы презентаций
- Разное
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Геометрия
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки
Содержание
- 1. Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки
- 2. яйцеклеткасперматозоидранние стадии развитиястволовые клеткивзрослые животныеиндивидуальное развитиерепрограммирование
- 3. for the discovery that mature cells can
- 4. до нашей эры до ИПС клетокЭмбриональные стволовые
- 5. Эмбриональныестволовые клеткиHM-1СпленоцитыГибридныеклоны серии НМСБластоцистаС57BLВведение гибридных клеток под кожу BALB/c nudeХИМЕРЫТЕРАТОМЫВведение гибридных клеток в полость бластоцисты
- 6. Тератомы полученные из гибридных клеток
- 7. Чем соматические клетки взрослого организма отличаются от
- 8. Чем соматические клетки взрослого организма отличаются от
- 9. Первая страница статьи Шиньи Яманаки в которой
- 10. Если цель получить стволовые клетки из соматических,
- 11. Важная деталь! Для введения трансгенов в работе
- 12. Virus vs. retrovirus
- 13. рекомбинантные ретровирусыСхема получения рекомбинантных ретровирусов для введения трансгенов в культуры клетокС модификациями из http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Genetic_RNA8C-Retroviruses-Mechanism_of_Replication.htm
- 14. фибробластыИПСКСтратегия отбора генов - кандидатовфибробласты несут трансгеную
- 15. ЭСКИПСК, полученные введенем24 факторовфибробластыОбработка фибробластов коктейлем из
- 16. Takahashi, Yamanaka, 2006 с модификациями
- 17. Без Oct4 или Klf4: колоний нетБез Sox2:
- 18. Плюрипотентность ИПСКИПСК полученные в работе Яманаки (так
- 19. Плюрипотентность ИПСКИПСК полученные в работе Яманаки (так
- 20. Плюрипотентность ИПСКTakahashi, Yamanaka, 2006При введении ИПСК первого
- 21. Спустя 11 месяцев вышла статья в Nature подтвердившая результаты работы Яманаки.Второе поколение ИПСК.
- 22. второе поколение ИПС клетокосновное отличие – Nanog-
- 23. ИПС клетки способны давать химерWernig et al.,
- 24. Мышата полученные из ИПС клетокOkita et al.,
- 25. У 10% «ИПС-мышей» (светлые мышата на предыдущем
- 26. Around the same time (Dec 2007)
- 27. Слайд 27
- 28. Та же технология, что и для ИПС
- 29. Плюрипотентность ИПСК человекаПо понятным причинам, самый строгий
- 30. Yu et al., 2007Плюрипотентность ИПСК человека: тератомный тест
- 31. Yu et al., 2007Плюрипотентность ИПСК человека: тератомный тестНервная ткань (производное эктодермы)Хрящ (производное мезодермы)Кишечный эпителий (производное энтодермы)
- 32. Слайд 32
- 33. Слайд 33
- 34. Слайд 34
- 35. Слайд 35
- 36. Слайд 36
- 37. Как сравнить перспективность разных подходов репрограммирования?Количество опубликованных статей (к марту 2013 года)
- 38. Слайд 38
- 39. Таким образом, получение ИПСК очень перспективный подход
- 40. Сравнение разных способов получения ИПС клеток Mostoslavsky 2011 с модификациями
- 41. Получение ИПСК – процесс медленный и не
- 42. химераВсе клетки этих мышей несут индуцибельныерепрораммирующие факторыiPS Соматические клетки+Dox
- 43. А можно ли репрограммировать все клетки?Линия мышей
- 44. Можно репрограммировать 100% клеток, но нужно время
- 45. Детерминированное или стохастическое репрограммирование?ДетерминированноерепрограммированиеДетерминированноерепрограммированиестохастическоерепрограммированиестохастическоерепрограммирование
- 46. Слайд 46
- 47. Репрограммирование лучше всего описывается стохастической не элитарной моделью
- 48. Deterministic versus stochastic model of reprogramming: new evidence from cellular barcoding techniqueAnastasia Yunusova, Veniamin Fishman, Gennady Vasiliev, Nariman Battulin
- 49. Слайд 49
- 50. (A) Body weight of 4F mice upon
- 51. Слайд 51
- 52. Слайд 52
- 53. Слайд 53
- 54. Слайд 54
- 55. Слайд 55
- 56. Слайд 56
- 57. Слайд 57
- 58. Papp, Plath 2011 с модификациямиИПСКапоптоз/старениепротиводействиеапоптозу/старениюпролиферация и уменьшениеразмеров клетокподавление
- 59. Первые этапы репрограммированияВ первые 1-2 дня:Укорачивается клеточный
- 60. Первые этапы репрограммированияЧерез 4-8 дней:Некоторые из
- 61. Поздние этапы репрограммированияВ небольшой доле клеток
- 62. Поздние этапы репрограммированияВ небольшой доле клеток
- 63. Drop-seq
- 64. Слайд 64
- 65. Слайд 65
- 66. Слайд 66
- 67. Optimal-Transport Analysis of Single-Cell Gene Expression Identifies Developmental Trajectories in Reprogramming
- 68. 251,203 cells
- 69. Modeling Developmental Processes with Optimal Transport
- 70. A Single-Cell RNA-Seq Time Course of iPSC Reprogramming
- 71. In Initial Stages of Reprogramming, Cells Progress toward Stromal or MET Fates
- 72. iPSCs Emerge from Cells in the MET
- 73. Trends in X-inactivation, X-reactivation, and pluripotency
- 74. Extra-Embryonic Cells Emerge during Reprogramming
- 75. Neural-like Cells Emerge during Reprogramming
- 76. Cellular Source and Mechanisms of High Transcriptome Complexity in the Mammalian Testis
- 77. Paracrine Signaling
- 78. Schematic of the reprogramming landscape in serum.
- 79. Соматическая память
- 80. Соматическая память
- 81. Слайд 81
- 82. Соматическая память
- 83. Соматическая память
- 84. Нарушения метилирования ДНК в iPS клетках
- 85. Нарушения метилирования ДНК в iPS клетках
- 86. Насколько ИПСК похожи на ЭСК?
- 87. Опишите стратегию лечения пациента от ВИЧ с использованием ИПС клеток.
- 88. Скачать презентанцию
яйцеклеткасперматозоидранние стадии развитиястволовые клеткивзрослые животныеиндивидуальное развитиерепрограммирование
Слайды и текст этой презентации
Слайд 2яйцеклетка
сперматозоид
ранние стадии развития
стволовые клетки
взрослые животные
индивидуальное развитие
репрограммирование
Слайд 4до нашей эры
до ИПС клеток
Эмбриональные стволовые клетки – хороший источник
плюрипотентных клеток, но этические, технические и проч. проблемы
Клонированные ЭС (ntES)
– еще лучше, но тоже много проблем
Слайд 5Эмбриональные
стволовые клетки
HM-1
Спленоциты
Гибридные
клоны серии НМС
Бластоциста
С57BL
Введение гибридных
клеток под кожу BALB/c nude
ХИМЕРЫ
ТЕРАТОМЫ
Введение
гибридных
клеток в
полость
бластоцисты
Слайд 7Чем соматические клетки взрослого организма отличаются от эмбриональных стволовых клеток?
Соматические
клетки
Выполняют определенные функции в организме (эпителии – барьерная функция,
мышечные клетки – движение, костные – опорная функция и т.д.)Имеют резко ограниченный спектр возможных дифференцировок
Эмбриональные стволовые клетки
Способны дифференцироваться в любую клетку взрослого организма
Способны неограниченно долго расти в культуре
Способны сохранять недифференцированное состояние
Слайд 8Чем соматические клетки взрослого организма отличаются от эмбриональных стволовых клеток?
На
самом деле, единственное ключевое отличие заключается в дифференциальной активности генов.
То есть все свойства клеток задаются набором активных в данный момент генов.Соматические клетки (фибробласты)
Коллаген
Thy1
Fsp1
и т.д.
Эмбриональные стволовые клетки
Oct4
Nanog
Sox2
Ras1
и т.д.
Слайд 9Первая страница статьи Шиньи Яманаки в которой была показана принципиальная
возможность индукции плюрипотентности в соматических клетках при помощи экзогенной экспрессии
транскрипционных факторов.Эта работа была отмечена Нобелевской премией в 2012 году.
Слайд 10Если цель получить стволовые клетки из соматических, какие факторы нужно
добавить?
Транскрипционные факторы специфичные для эмбриональных стволовых клеток
Гены, экспрессия которых повышается
при формировании опухолей (так как предполагалось , что в процесс опухолевого перерождения может иметь общие черты с процессом репрограммирования)Гены для которых была показана роль в поддержании плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток
Гены-кандидаты в исследовании Яманаки:
Ecat1, Dppa5, Fbxo15 , Nanog , ERas , Dnmt3l , Ecat8 , Gdf3 , Sox15 , Dppa4 , Dppa2 , Fthl17 , Sall4 , Oct4 , Sox2 , Rex1 , Utf1 , Tcl1 , Dppa3 , Klf4 , β-catenin , c-Myc , Stat3 , Grb2
Слайд 11Важная деталь! Для введения трансгенов в работе Яманаки использовали ретровирусные
векторы. Ретровирусные векторы обеспечивают стабильную экспрессию трансгена в клетках на
протяжении длительного времени, необходимого для репрограммирования.ретровирусные векторы созданы на основе Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV). Этот вирус заражает и мышиные и человеческие клетки.
для создания вектора вирусные гены, gag, pol and env, заменяют генно-инженерной конструкцией, которую экспрессируют в специальной клеточной линии - упаковщике.
в вирионы упаковывается только интересующая конструкция, т.к. она содержит сигнал упаковки.
для того чтобы предотвратить появление потенциально опасного искусственного вируса из вектора удаляют все возможные участки гомологии с природными ретровирусами.
Слайд 13рекомбинантные ретровирусы
Схема получения рекомбинантных ретровирусов для введения трансгенов в культуры
клеток
С модификациями из http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Genetic_RNA8C-Retroviruses-Mechanism_of_Replication.htm
Слайд 14фибробласты
ИПСК
Стратегия отбора генов - кандидатов
фибробласты несут трансгеную кассету [βгалактозидаза+ген устойчивости
к антибиотику G418] под контролем промотора гена Fbx15. Fbx15 неактивен
в фибробластах, но активен в ЭСК, в случае успешного репрограммирования трансгенная кассета активируется и клетки приобретают устойчивость к G418инфекция ретровирусными векторами и селекция репрограммировавщихся клеток по устойчивости к G418
![фибробластыИПСКСтратегия отбора генов - кандидатовфибробласты несут трансгеную кассету [βгалактозидаза+ген устойчивости к антибиотику G418] под контролем промотора гена](/img/tmb/5/499619/f4eebcfc9f1d4118296bbed0814c21f9-800x.jpg "Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки фибробластыИПСКСтратегия отбора генов - кандидатовфибробласты несут трансгеную кассету [βгалактозидаза+ген устойчивости к")
Слайд 15ЭСК
ИПСК, полученные введенем
24 факторов
фибробласты
Обработка фибробластов коктейлем из 24 ретровирусов приводит
к появлению колоний клеток с морфологией подобной морфологии ЭСК. Эти
колонии также устойчивы к G418.Takahashi, Yamanaka, 2006
Слайд 17Без Oct4 или Klf4: колоний нет
Без Sox2: колонии формируются, но
фенотип отличается
Без c-Myc: очень низкая эффективность
24 гена-кандидата, все ли они
важны?Таким образом были обнаружены 4 транскрипционных фактора экспрессия которых необходима и достаточна для индукции плюрипотентности в фибробластах мыши.
без факторов
4 фактора
3 фактора
2 фактора
10 факторов
число колоний
Takahashi, Yamanaka, 2006 с модификациями
Слайд 18Плюрипотентность ИПСК
ИПСК полученные в работе Яманаки (так называемые ИПСК первого
поколения) успешно прошли часть тестов на плюрипотентность. Например, тератомный тест.
Takahashi,
Yamanaka, 2006 с модификациями
Слайд 19Плюрипотентность ИПСК
ИПСК полученные в работе Яманаки (так называемые ИПСК первого
поколения) успешно прошли часть тестов на плюрипотентность. Например, тератомный тест.
хрящ
хрящ
нервная
тканьэпителий
адипоциты
мышечная ткань
Takahashi, Yamanaka, 2006 с модификациями
Слайд 20Плюрипотентность ИПСК
Takahashi, Yamanaka, 2006
При введении ИПСК первого поколения в реципиентную
бластоцисту формировались химерные эмбрионы. Однако вклад введенных ИПСК не прослеживался
позже 13,5 дня развития и не удалось получить ни одного взрослого химерного животного. Вывод: ИПСК первого поколения имели ограниченный потенциал развития (то есть их потенциал не был равен потенциалу ЭСК).На фотографии эмбрионы 13,5 дня развития зеленые клетки – потомки ИПСК введённых в эмбрион на стадии бластоцисты
Слайд 21Спустя 11 месяцев вышла статья в Nature подтвердившая результаты работы
Яманаки.
Второе поколение ИПСК.
Слайд 22второе поколение ИПС клеток
основное отличие – Nanog- или Oct4-активируемый ген
устойчивости для селекции репрограммированных клеток
те же 4 гена (Oct4, Sox2,
Klf4 и c-myc)гораздо больше похожи на ЭС клетки, чем первое поколение
Слайд 23ИПС клетки способны давать химер
Wernig et al., 2007
Взрослая химерная мышь,
полученная введением ИПСК в бластоцисту. Светлые участки шкуры развились из
введенных клеток, темные – из клеток реципиентной бластоцисты.Новорожденные мышата. Поскольку ИПСК были маркированы GFP, участки шкуры развившиеся из введенных клеток флюоресцируют зеленым при облучении ультрафиолеом.
УФ
Слайд 24Мышата полученные из ИПС клеток
Okita et al., 2007
У химерных животных
ИПСК способны дифференцироваться в половые клетки и таким образом проходить
в следующее поколение. Помет одного химерного животного, светлые мышата получились при оплодотворении половых клеток развившихся из ИПСК.
Слайд 25У 10% «ИПС-мышей» (светлые мышата на предыдущем слайде) возникали опухоли
вследствие активации онкогена c-myc
Okita et al., 2007
ИПСК могут быть не
безопасны
Слайд 28Та же технология, что и для ИПС клеток мыши
Удалось получить
ИПС клетки из фибробластов взрослого донора (36 лет)
В целом,
процесс получения ИПС клеток человека дольше колонии формируются только на 25 день (у мыши на 12 день)ИПС клетки человека
Слайд 29Плюрипотентность ИПСК человека
По понятным причинам, самый строгий тест на плюрипотентность
– тест на химеризм, не возможно провести для ИПСК человека.
Поэтому плюрипотентность проверяют in vitro при дифференцировке в культуре клеток или in vivo при формировании тератомTakahashi et al., 2007
Иммуноцитохимическое выявление различных типов клеток возникающих при дифференцировке ИПСК человека in vitro
F – печеночные клетки (алфа-фетопротеин +)
G – мезенхимные клетки (виментин +)
H – гладкомышечные клетки (α-SMA +)
I – мышечные клетки (десмин +)
J – нейроны (βIII-тубулин +)
K – глиальные клетки (GFAP +)
Слайд 31Yu et al., 2007
Плюрипотентность ИПСК человека: тератомный тест
Нервная ткань (производное
эктодермы)
Хрящ (производное мезодермы)
Кишечный эпителий (производное энтодермы)
Слайд 37Как сравнить перспективность разных подходов репрограммирования?
Количество опубликованных статей (к марту
2013 года)
Слайд 39Таким образом, получение ИПСК очень перспективный подход репрограммирования генома, однако,
имеет ряд серьезных недостатков
применение ретровирусов при репрограммировании приводит к
вставке чужеродного генетического материала в случайные сайты генома (инсерционный мутагенез)в репрограммирующем коктейле присутствуют онкогены (c-myc и Klf4), их эктопическая экспрессия может приводить к опухолевому перерождению клеток
крайне низкая эффективность репрограммирования. Полностью репрограммируются лишь 0,001-1% клеток
Слайд 41Получение ИПСК – процесс медленный и не эффективный
Репрограммирование в
системе гибридных клеток занимает примерно 1-2 суток
Репрограммирование при клонировании –
часы Репрограммирование при получении ИПСК мыши минимум 7-10 дней
Слайд 42химера
Все клетки этих мышей
несут индуцибельные
репрораммирующие факторы
iPS
Соматические клетки
+Dox
Слайд 43А можно ли репрограммировать все клетки?
Линия мышей несущая Dox-индуцибельные Oct4,
Sox2, Klf4 и c-myc
+ Gfp под промотором Nanog (т.е.
репрограммированные клетки становятся «зелеными») Выделяем В -клетки
Рассаживаем индивидуально
Добавляем Dox
Ждем появления «зеленых»
клеток
Слайд 44Можно репрограммировать 100% клеток, но нужно время
до 18 недель!
Длительность индукции, в неделях
Слайд 45Детерминированное или стохастическое репрограммирование?
Детерминированное
репрограммирование
Детерминированное
репрограммирование
стохастическое
репрограммирование
стохастическое
репрограммирование
Слайд 48Deterministic versus stochastic model of reprogramming: new evidence from cellular
barcoding technique
Anastasia Yunusova, Veniamin Fishman, Gennady Vasiliev, Nariman Battulin
Слайд 50(A) Body weight of 4F mice upon continuous administration of
doxycycline (Dox n = 11; +Dox n = 26). (B)
Survival of 4F mice upon continuous administration of doxycycline (Dox n = 11; +Dox n = 26). ***p < 0.0005 according to log-rank (Mantel-Cox) test. (C) Schematic representation of cyclic doxycycline administration protocol. (D) qPCR analysis of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc in blood samples of 4F mice after 2 days of doxycycline administration. **p < 0.005, ***p < 0.0005, and ****p < 0.0001 according to one-way ANOVA with Bonferroni correction. (E) Teratomas (arrows) in 4F mice carrying two copies of OSKM and rtTA cassette after 8 weeks of cyclic doxycycline administration. (F) Histological analysis of teratoma with ectoderm, mesoderm, and endoderm. Scale bar, 50 mm. Data are presented as mean ± SEM. See also
Слайд 58Papp, Plath 2011 с модификациями
ИПСК
апоптоз/старение
противодействие
апоптозу/старению
пролиферация и уменьшение
размеров клеток
подавление активности генов
соматических клеток
мезенхимально-эпителиальный
переход
(подавление активности Snail,
повышение активности E-cadherin)
Появление маркеров
ЭСК (SSE1, щелочная
фосфатаза)
«недоИПСК»
ИПСК ранних
пассажей
Стирание эпигенетической
памятитранскрипционный профиль
подобный ЭСК
независимость от экзогенной экспрессии
репрограммирующих факторов
Слайд 59Первые этапы репрограммирования
В первые 1-2 дня:
Укорачивается клеточный цикл (фибробласты делятся
раз в 22 часа, ЭС клетки раз в 11-12 часов)
Размеры
клеток уменьшаютсяЛишь немногие клетки приобретают эти свойства, часто клетки уходят в апоптоз.
Блокировка апоптотического пути увеличивает выход репрограммированных клеток.
Слайд 60 Первые этапы репрограммирования
Через 4-8 дней:
Некоторые из быстро делящихся маленьких
клеток формируют плотные колонии. Этот этап называется мезенхимально-эпителиальный переход.
Подавляется активность
генов, характерных для фибробластов (Thy1, Snail)Появляеся E-cadherin
Активация бета-катенин - E-cadherin сигнального пути увеличивает выход репрограммированных клеток.
Слайд 61 Поздние этапы репрограммирования
В небольшой доле клеток добравшихся до этого
этапа:
появляются поверхностные антигены, свойственные ЭС клеткам (SSEA1)
появляется активность
щелочной фосфатазы, еще одного маркера ЭС клетокВсе описанные этапы репрограммирования происходят под действием репрограммирующих факторов. Прекращение эктопической экспрессии факторов, на этой стадии, приводит к возврату в исходное состояние.
Слайд 62 Поздние этапы репрограммирования
В небольшой доле клеток добравшихся до этого
этапа:
закрепляются свойства, характерные для ЭС клеток
Плюрипотентное состояние поддерживается
вне зависимости от экзогенной экспрессии репрограммирующих факторовФиниш!
Слайд 67Optimal-Transport Analysis of Single-Cell Gene Expression Identifies Developmental Trajectories in
Reprogramming
Слайд 72iPSCs Emerge from Cells in the MET Region
Ancestor trajectory of
day 18 iPSCs in 2i (left) and serum (right) (color
shows day, intensity shows probability).
