Кода необходимо детектировать НК? Для решения различных фундаментальных задач

биологии, биоорганической химии и биохимии

Для диагностики заболеваний
Для экспертиз

В разных объектах:

В растворах
В гелях
На мембранах
В клетках
В биологическом материале
(в крови, тканях органов, волосах,
листьях, культуре клеток и т.п.)

In vitro

Количественное определение НК в
растворе:
Точное измерение выходов кДНК перед
клонированием
Оценка количества НК в различных препаратах
Определение выхода плазмид
Определение количества ДНК-матриц перед
торможением в геле, опытами по футпринтингу ДНК
Определение количества продуктов ПЦР
(полимеразной цепной реакции)

In vivo
Функционирование ДНК и РНК в клетке

Что определять:
Суммарное количество НК
ДНК и РНК отдельно
Несколько молекул ДНК
Отдельные участки в ДНК

заболевания;

определение совместимости донора и реципиента.

Экспертизы:

установление биологического родства, генетическая

экспертиза
отцовства;

ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний

разных тканей, для культуры клеток
млекопитающих и для бактериальных клеток

-Лизис клеток
(необходимо избегать фрагментации длинных молекул ДНК
за счет механической деструкции или действия эндогенных нуклеаз)

Механическое разрушение
Химическая обработка (например, лизис с помощью
детергентов или хаотропных агентов)
Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеиназы К)

Фенольная или фенольно- хлороформная экстракция

-Отделение от белков и др.молекул
Центрифугирование, осаждение этанолом

presence of high concentrations of chaotropic salts (e.g., guanidinium HCl).
Protein

does not bind under these conditions.
Silica membranes or columns are washed with an alcohol-based solution to remove the salts.
DNA is eluted from the membrane with a low-ionic-strength solution, such as a low-salt buffer or water.

Advantages
Fast purification
Amenable to automation
No centrifugation required (can use vacuum)
No organic solvents or precipitation steps

красителей

Стандартные методы определения общего содержания НК:
Для решения разных задач методы

определения НК варьируют от определения общего содержания НК до определения одной молекулы или даже одного гена.

– интенсивность прошедшего света,
I0 – интенсивность падающего света
c – концентрация,

моль/л
l – длина оптического пути, см

ε – молярный коэффициент экстинкции, М-1см-1

А - поглощение

Однолучевой спектрофотометр:

А260/А280 1.8, а
А260/А280 для чистой РНК = 2.0
λ

макс НК = 260 нм

А260 = 1, кювета 1см
50 мкг/мл, двухцепочечной ДНК
40 мкг/мл одноцепочечной ДНК и РНК

Определение по поглощению при 260 нм

Синтетические олигонуклеотиды:

pg/ml)
PicoGreen® method. Mix sample with reagent, wait 5 minutes

and read with a fluorimeter.

Lower sensitivity methods
Estimation of concentration based on comparison to a known concentration standard on an agarose gel.

Standard

DNA Sample

ДНК и РНК в геле
Определение размера ДНК
Оценка концентрации

путем сравнения со стандартом

Новый краситель - SYBR Green:

Механизм:
разгорание флуоресценции при
интеркалировании красителя
в двойную спираль

λ фл 590

λфл 520 nm

Определение 10-50 нг ДНК и РНК в геле
Определение размера ДНК
Оценка концентрации путем сравнения со стандартом

a
polymerase-catalyzed chain reaction.
Nobel Prize 1993
Полимеразная цепная реакция
ПЦР - многократное избирательное

копирование определённого участка ДНК (в том числе и из смеси ДНК) при помощи ДНК-полимеразы и двух олигонуклеотидных затравок.
.

Мишени для ПЦР:
Следы крови
Один волос
Соскоб из-под ногтей
Насекомые в янтаре
Египетские мумии
Зубная щетка
Зуб неандертальского ребенка

Kary Mullis

Используется для
амплификации определенного участка ДНК
введения мутаций в ДНК
диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных)
установления отцовства
клонирования генов, выделения новых генов.

Затравки (праймеры) комплементарны
определенному участку в разных цепях ДНК

2 – отжиг при 68 oC;
3 – удлинение при

72 oC;
4 – окончание первого цикла.
(P – Taq-ДНК-полимераза). Две образующихся цепи ДНК являются
шаблоном для следующего цикла. Таким образом, происходит удваивание количества ДНК в каждом новом цикле.

Taq-ДНК-полимераза – полимераза из термофильных бактерий

Полимеразная цепная реакция

где n – количество циклов
Агарозный гель продуктов ПЦР
(прокрашен этидий бромидом)
Дорожки:
М-маркеры
1-отрицательный

контроль
2-5- пробы, в которых нет амплификации ДНК-мишени
6-7- пробы, в которых есть амплификация ДНК-мишени
8- положительный контроль

вирусной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и

фермент – РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу).

1-ый этап – получение ДНК-копии путем обратной транскрипции
2-ой этап - ПЦР кДНК

Обратная транскрипция

молекул ДНК,
например, ДНК - возбудителя какого-либо заболевания (бактериальные, грибковые,

вирусные инфекции)
ДНК-диагностика различных заболеваний (пренатальная диагностика и др.)

РНК ПЦР-анализ РНК-содержащих вирусов

( количественная ПЦР в реальном времени) – методика, базирующаяся на

ПЦР. Особенности и отличия от ПЦР:

наряду с амплификацией ДНК определяется ее количество. Определяется абсолютное или относительное (когда нормализуют к количеству ДНК на входе) количество копий.
амплифицированная ДНК определяется по мере прохождения реакции в реальном времени после каждого цикла амплификации. При ПЦР – в конце реакции.
не требуется проведения электрофореза
автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов


В ПЦР-РВ НК используют два основных подхода , включающие: 

— неспецифические флуоресцентные красители, интеркалирующие в любое место в двуцепочечных молекулах ДНК
SybrGreen, EthdBr

— специфические модифицированные олигодезоксинуклеотиды (ДНК-зонды), которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.
TaqMan Assay
Мolecular beacons

зондовTaqman. Ф – флуорофор. Г – гаситель

с
использованием зондов Molecular Beacons. Ф – флуорофор. Г –

гаситель

Внутренняя область зондов содержит
нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области.

плавления
Плавление продуктов амплификации

ДНК-мишени.

CТ (пороговый цикл) – пересечение кривой амплификации и пороговой

линии (коли-
чество циклов, необходимых для достижения порога). Он является относительной мерой концентрации ДНК-мишени в реакции ПЦР.
CТ обратно пропорционально логарифму первоначального количества ДНК-мишени.

относительное или абсолютное количество.
Относительное количество базируется на нормализации экспрессии изучаемых

генов к экспрессии внутренних стандартных генов. В качестве стандартов выбраны гены, экспрессия которых не меняется в разных условиях и образцах ( напр., ген актина).
Абсолютное количество дает точное число молекул ДНК-мишени путем
сравнения со стандартной ДНК (известной концентрации).

Определение концентрации ДНК/РНК с использованием ПЦР-РВ

Определение «порогового» цикла для исследуемых проб.
Использование стандартных растворов ДНК для построения
калибровочной кривой.
Расчет исходной концентрации НК.

РНК
Применение ПЦР-РВ в фундаментальных исследованиях

Применение ПЦР-РВ в медицине
количественные измерения

ДНК и РНК инфекционных агентов
мониторинг эффективности проводимой терапии, оценка
клинического прогноза

иммобилизованной ДНК
с олигонуклеотидным зондом
Обнаружение НК гибридизацией

зондом, несущим биотин
образование прочного комплекса биотин-стрептавидин (стрептавидин «пришит» к

ферменту HRP - пероксидазе хрена)
хемолюминесценция (катализатор - пероксидаза хрена)

Зонд метится какой-либо репортерной группой:
радиоактивным изотопом,
флуорофором,
ферментом, дающим окрашенный или люминесцирующий продукт

на носитель (нитроцеллюлозный фильтр);

Нозерн (Nothern)-блоттинг –
перенос РНК;

Вестерн (Western) -блоттинг

–
перенос белка

Схема проведения гибридизации
ДНК по Саузерну

electrophoresis. Specific DNA fragments are then identified
by hybridization with

an appropriate probe.

Схема проведения гибридизации
ДНК по Саузерну

РНК.

Синтетические ДНК-зонды, которые флуоресцируют при связывании с одноцепочечной ДНК-мишенью.