Слайд 1Молекулярная биология прокариот
Каменский Петр Андреевич
peter@protein.bio.msu.ru
Основная литература:
1. L.Snyder. Molecular Genetics of
Bacteria. Любое издание после 2010 года.
2. C.Lewin. Genes (или переводные
издания). Любое издание после 2010 года.
3. M.Singer, P.Berg. Genes and Genomes (или переводные издания). Любое издание после 2010 года.
Дополнительная литература:
1. Спирин А. С. Молекулярная биология. Рибосомы и биосинтез белка. Любое издание после 2010 года.
2. B.Alberts. Molecular Biology of the Cell (или переводные издания). Любое издание после 2010 года.
Слайд 2Лекция 1.
Репликация. Транскрипция. Трансляция.
Слайд 3Надо вспомнить структуру ДНК и принцип комплементарности !
Слайд 4Общая схема репликации бактериальной ДНК
1. ДНК-полимераза III синтезирует новую цепочку
ДНК на матрице лидирующей цепи. Праймаза синтезирует фрагмент Окадзаки на
отстающей цепи.
2. PolIII удлиняет фрагмент Окадзаки.
3. Материнские цепочки расплетаются, праймаза синтезирует новый фрагмент Окадзаки.
Слайд 54. Pol III удлиняет фрагмент Окадзаки на отстающей цепи и
достигает предыдущего фрагмента.
5. Pol I удаляет РНК-часть предыдущего фрагмента Окадзаки
и заменяет ее на последовательность ДНК.
6. Лигаза соединяет два фрагмента ДНК в одну непрерывную цепочку. Далее снова начинается п.1.
Общая схема репликации бактериальной ДНК
Слайд 6Два ДНК-полимеразных комплекса, синтезирующие на лидирующей и отстающей цепи, на
самом деле никогда не расходятся и работают скоординированно
Тромбонная репликация бактериальной
ДНК
Слайд 7Инициация репликации бактериальной ДНК
Участок инициации – ori c – содержит
много участков связывания белка DnaA.
DnaA в АТФ-связанной форме приходит в
ori c в больших количествах и, связываясь с ДНК, формирует петлю. Это приводит к частичному расплетанию двойной спирали ДНК около петли.
Белок DnaC помогает сесть на расплетенную ДНК хеликазе DnaB.
Слайд 8Инициация репликации бактериальной ДНК
Хеликаза DnaB начинает расплетать спираль еще сильнее.
Приходит
белок SSB и закрепляет одноцепочечную структуру ДНК в участке инициации.
Приходит
праймаза DnaG, начинается репликация.
Слайд 9Терминация репликации бактериальной ДНК
Изучена только у E.coli, и то плохо
А.
Две вилки репликации движутся навстречу друг другу. Поблизости от участка
терминации имеются участка terA и terB, пройдя через которые, вилки репликации не могут «повернуть назад».
В. Когда две вилки репликации встречаются между участками terA и terB, происходит отсоединение аппарата репликации от ДНК и высвобождение двух двуцепочечных молекул.
Слайд 10Основные белки репликации E.coli
Слайд 11Антибиотики, ингибирующие репликацию
Интеркаляторы – молекулы, способные встраиваться между двумя цепочками
ДНК.
Интеркаляторы «скрепляют» две цепочки ДНК друг с другом, что безусловно
препятствует репликации.
Поскольку интеркаляторы очевидно будут действовать и на ДНК человека, их использование как антибиотиков ограничено. Фактически, лекарства на их основе используются только для местного применения – интеркаляторы входят в состав мазей для лечения порезов и кожных воспалений.
Слайд 12Антибиотики, ингибирующие репликацию
Хинолоны – вещества, ингибирующие топоизомеразу II (ДНК-гиразу), наводящую
суперскрученность на вновь синтезированную ДНК после репликации.
Хинолоны (особенно ципрофлоксацин и
левофлоксацин) очень широко используются в медицине. Они почти не действуют на организм хозяина, нетоксичны и дешевы в производстве.
Механизм действия ясен не до конца. Известно, что использование хинолонов приводит к ковалентной сшивке ДНК с гиразой и к последующей деградации ДНК, но как именно это происходит – до сих пор загадка.
Слайд 13Транскрипция
Синтез РНК на матрице ДНК
Рибонуклеотиды:
РНК – преимущественно одноцепочечные молекулы, но
комплементарность-то ее нуклеотидов никуда не делась. Следствием этого являются разнообразные
вторичные структуры РНК.
Слайд 14РНК-полимераза
Сигма-субъединица придает комплексу функциональность: именно она физически взаимодействует с транскрибируемой
РНК.
Слайд 15РНК-полимераза в комплексе с ДНК
Слайд 16РНК-полимераза транскрибирует только одну цепочку ДНК.
Матричная цепь (транскрибируемая) комплементарна синтезируемой
РНК.
Кодирующая цепь (нетранскрибируемая) идентична синтезируемой РНК.
Слайд 17Структура типичного промоторного участка E.coli
РНК-полимераза E.coli начинает синтез с А
или с G. Праймер ей не нужен.
Слайд 18Общая схема транскрипции
Коровый РНК-полимеразный комплекс не может узнать промотор и
связаться с ним, пока не придет сигма.
Когда сигма приходит, образовавшийся
холофермент связывается с промотором и двигается по цепочке ДНК. Дойдя до нуклеотида +1, холофермент устанавливает соответствующий РНК-нуклеотид, и транскрипция начинается.
Слайд 19Общая схема транскрипции
После размещения первого нуклеотида РНК сигма отваливается, и
коровый комплекс осуществляет элонгацию, продвигаясь по ДНК в составе «транскрипционного
пузыря».
Дойдя до терминаторной последовательности в ДНК, коровый комплекс прекращает транскрипцию, сходит с ДНК и высвобождает новосинтези-рованную цепочку РНК.
Слайд 20Расплетание ДНК в точке начала транскрипции происходит благодаря изомеризации РНК-полимеразы
Слайд 21Элонгационный транскрипционный комплекс
Слайд 22Фактор-независимая терминация транскрипции
Происходит на вот таких участках:
РНК-полимераза задерживается на полиА
участка терминации. Это позволяет сформироваться шпильке, состоящей из инвертированных повторов.
Эта шпилька, в свою очередь – сигнал РНК-полимеразе на остановку транскрипции и диссоциацию из комплекса с ДНК.
Слайд 23Фактор-зависимая терминация транскрипции
Происходит на вот таких участках:
РНК-полимераза делает паузу на
специальном участке ДНК (участок паузы). Это позволяет
фактору терминации Rho связаться
с участком rut на РНК и начать движение по РНК «вверх». Когда он достигает транскрипционного пузыря, он проявляет хеликазную активность и расплетает гибрид ДНК-РНК. Это приводит к высвобождению РНК, а следом и РНК-полимераза диссоциирует из комплекса с ДНК.
Слайд 24Антибиотики, ингибирующие транскрипцию
Рифамицины – класс соединений, связывающих бета-субъединицу РНК-полимеразы и
блокирующие присоединение новых нуклеотидов к растущей цепочке РНК.
Самый известный антибиотик
– рифампицин, использующийся в медицине с середины прошлого века и до сих пор являющийся одним из основных средств против туберкулеза.
Слайд 25Антибиотики, ингибирующие транскрипцию
Лассо-пептиды связывают бета-субъединицу РНК-полимеразы и ингибируют ее активный
центр.
В клиническую практику пока не вошли, точный молекулярный механизм действия
изучен плохо.
Слайд 26Трансляция
Синтез белка на матрице мРНК
Рибосома – молекулярная машина, осуществляющая трансляцию
мРНК и биосинтез белка. Состоит из двух субъединиц, каждая из
которых, в свою очередь, собирается из РНК и белков.
Слайд 27тРНК – адапторная молекула, задающая однозначное соответствие между каждым триплетом
(тремя нуклеотидами) мРНК и аминокислотой.
Но не наоборот: генетический код
вырожден, и одна аминокислота может кодироваться несколькими разными триплетами.
Слайд 28Участки связывания тРНК на границе большой и малой субъединиц:
А-участок –
для вновь пришедшей тРНК, принесшей новую аминокислоту
Р-участок – для тРНК,
на которой висит растущий полипептид
Е-участок – для тРНК, которая отдала аминокислоту в растущий полипептид и больше в рибосоме не нужна. Из этого участка она высвобождается.
Слайд 29Аминоацилирование тРНК – наведение ковалентной связи с аминокислотой
Слайд 30Инициация трансляции
Аналог промотора в ДНК – последовательность Шайна-Дальгарно в мРНК
Эту
последовательность узнает рибосома (точнее – 3’-конец рРНК малой субъединицы) и
связывается с ней.
Слайд 31Инициация трансляции
Закончившая предыдущий акт трансляции рибосома диссоциирует на субъединицы. С
малой субъединицей связывается фактор инициации IF3, предотвращающий реассоциацию.
Фактор инициации IF3
связывается с А-участком, чтобы закрыть его от тРНК
Малая субъединица с двумя факторами связывается с последовательностью Шайна-Дальгарно в транслируемой мРНК. После этого к комплексу присоединяется еще один фактор инициации, IF2, и специальная инициаторная тРНК, связанная с формилметионином.
Слайд 32Инициация трансляции
Инициаторная тРНК, связанная с IF2, устанавливается в Р-участке рибосомы,
в котором в этот момент находится стартовый кодон.
Такая конфигурация инициаторного
комплекса стимулирует гидролиз ГТФ, связанного с IF2. Это, в свою, очередь, приводит к изменению конформации комплекса и к спонтанному высвобождению из него всех трех факторов инициации.
На финальном этапе инициации к малой субъединице со связанной с ней инициаторной тРНК присоединяется большая субъединица. После этого начинается элонгация трансляции.
Слайд 33Элонгация трансляции
Связывание аминоацил-тРНК
Аминоацилированная тРНК приходит в пустой А-участок и связывается
своим антикодоном с расположенным в нем кодоном мРНК. Белковый фактор
этого процесса – EF-Tu.
2. Транспептидация
Перенос полипептида с тРНК, висящей в Р-участке, на аминокислоту тРНК, висящей в А-участке.
Слайд 34Элонгация трансляции
3. Транслокация
Процесс переноса тРНК с полипептидом из А- в
Р-участок. Белковый фактор этого процесса – EF-G.
Слайд 35Терминация трансляции
Терминация происходит на так называемых стоп-кодонах мРНК, для которых
нет тРНК. Вместо нее имеется специальный фактор RRF, структура которого
схожа со структурой тРНК, что и позволяет ему связаться со стоп-кодоном в А-участке рибосомы.
Такое связывание – сигнал для остановки трансляции, диссоциации всех факторов, тРНК и мРНК из комплекса с рибосомой и диссоциации самой рибосомы на субъединицы. После этого с малой субъединицей связывается фактор инициации IF3, и все начинается сначала.
Слайд 36Антибиотики, ингибирующие трансляцию
Самая большая группа антибиотиков, очень широко использующиеся в
клинике, поскольку бактериальная и эукариотическая системы трансляции структурно и механистически
очень сильно отличаются друг от друга, и поэтому подавляющее большинство трансляционных антибиотиков никак не воздействуют на трансляцию в хозяйских клетках.
