Молекулярно – генетические методы изучения генетики человека

генетики человека Проф Каредина В.С.

клеток
Биохимический метод
Молекулярно – генетические
Метод приемных детей
Антропометрический
Дерматоглифика

выявление изменений в определенных участках ДНК, гена или хромосомы. В

их основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК. В 70-80 гг. в связи с прогрессом в молекулярной генетике и успехами в изучении генома человека молекулярно-генетический подход нашел широкое применение.
.

или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки)

или отдельные ее фрагменты. В последнем случае, чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.
Для этого пользуются полимеразной цепной реакцией — быстрым методом ферментативной репликации определенного фрагмента ДНК. С его помощью можно амплифицировать любой участок ДНК, расположенный между двумя известными последовательностями.

существуют в клетке, невозможно. Поэтому прежде их необходимо разделить на

части, обработать разнообразными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами. Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разрыва строго специфичны для данного образца. Расщепление ДНК рестриктазами дает характерный набор фрагментов (4-6 пар оснований), отличающихся по длине.

с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламид-ного геля. Под

действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

и стандартным (с известными размера­ми) отрезком ДНК.
Молекулярно -.генетическую диа­гностику наследственных

болезней ис­пользуют и для изучения генома чело­века. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с об­разованием одноцепочечных фрагмен­тов, которые переносят на нитроцеллюлезный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

изучения генома человека. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты

ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну.
Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят на нитроцеллюлезный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

солевым раствором. На гель накладывают нитроцеллюлезный фильтр, а сверху помещают

сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается солевой раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. Затем одноцепочечные ДНК фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью

или частично комплементарна изучаемому участку геном­ной ДНК.
Результат гибридизации комплементарных цепей радиоактивного ДНК-зонда и фрагмента ДНК обнаруживают с помощью радиоавтографии: каждая комплементарная зонду последовательность ДНК проявляется в виде радиоактивной полосы.

участке исследуемого гена и установить, несет ли данный ген какие-либо

дефекты. Так, разработаны эффек­тивные методы синтеза искусственных ДНК-зондов, которые используются в пренатальнои диагностике наследст­венных заболеваний. Для этого из эмб­риональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости плода, выделяют ДНК и гибридизируют ее с помо­щью Саузерн-блоттинга с радиоактивным ДНК-зондом.

только с ДНК-зондом, комплементарным мутантной последовательности.
В настоящее время имеются различ­ные

методы выявления мутаций. Их делят на прямые и косвенные.
Прямая диагностика мутаций включает ряд методов:
1. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование), дающее возможность выявить замены оснований, делеции и вставки в изучаемом фрагменте.

50% нуклеотидных замен ведет к изменению сайта (места) рестрикции. Это

делает возможным выявить мутацию путем рестриктного анализа.
Проведение аллелоспецифической гибриди-зации с синтетическими зондами, что позволяет обнаружить мутации в геномной ДНК. Последовательность оснований в зонде может быть задана по дефектному или нормальному варианту гена. В обоих случаях зонд используется для гибридизации с фрагментами ДНК обследуемого индивида.

оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Метод

заключается в электрофорезе двух цепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле.
Регистрация изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК.

получения специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов. Синтезируемый

белок анализируют с помощью электрофореза. Изменение подвижности белка указывает на наличие мутации.

нуклеотидная последовательность гена еще не расшифрована, но известно его положение

на генетической карте. Технические приемы такие же, как и в прямой диагностике, но добавляется математический анализ.
Диагностике мутаций способствует нахождение в геноме полиморфных по длине рестрикционных фрагментов. Их можно выявить с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

ди-, три- и тетрануклеотидные тандемно повторяющиеся последовательности ДНК. Они используются

в качестве маркерных локусов аллельных вариантов гена или маркеров дефектных мутаций..

тяжелого заболевания нервной системы у человека — хореи Гентингтона (ХГ).

Болезнь, проявляющаяся после 40 лет, выражается в расстройстве движений, снижении интеллекта, в нарушении эмоционально-волевой сферы и др. Этот недуг наследуется по аутосомно-доминантному типу со 100 % пенетрантностью. Ген локализован в коротком плече 4-й хромосомы.

последовательность представлена многократным повторением трех нуклеотидов — ЦАГ (цитозин-аденин-гуанин) геномной

ДНК. В норме количество таких повторов колеблется от 11 до 34, а у больных ХГ их 37-86 (в среднем 45). И, следовательно, хорея Гентингтона относится к наследственным заболеваниям, при котором мутация гена состоит в экспансии (многократном увеличении числа копий) тринуклеотидных ЦАГ-повторов.

молодом возрасте, наследуется по отцовской линии и нарастает в последующих

поколениях. Ученые пришли к выводу, что число ЦАГ- повторов тесно связано и со сроком появления первых симптомов, и с тяжестью заболевания. В 1992 г. экспансия тринуклеотидных ЦТГ- повторов была обнаружена в гене, который вызывает миотоническую дистрофию. Этот ген, названный ДМ-1, был картирован на 19-й хромосоме.

она колеблется от 5 до 30, то у больных миотонической

дистрофией, количество повторов может достигать многих сотен.
Болезнь наследуется по аутосомно-доминантному типу, обычно начинается в зрелом возрасте и проявляется прогрессирующей мышечной слабостью, а в некоторых случаях задержкой умственного развития, поражением скелета, сердечнососудистой системы и глаз.

или четырех по­колений. Если в первом поколении болезнь возникает в

зрелом возрасте и проявляется лишь развитием катарак­ты или легким нарушением сократимости мышц, то в последующих поколениях болезнь начинается сразу после рождения ребенка, у которого развива­ется выраженная мышечная слабость, задержка умственного развития.

и для ряда других наследственных заболеваний нервной системы человека: болезни

Кеннеди, синдрома фрагильной (ломкой) Х-хромосомы и др.