Проточная цитометрия

оптических параметров, охаракте-
ризовать физические и биохимические свой-
ства клеток. В ходе

анализа одновременно
производят фотометрию и флуориметрию
отдельных клеток, которые в составе лами-
нарного потока жидкости поочерёдно пересе-
кают монохроматический световой поток,
создаваемый лазером.

Гелий-неоновый лазер, λ = 633 nm (красный)
Аргоновый лазер, λ = 488 nm
Гелий-кадмиевый лазер, λ около 400 nm (УФ)

запатентован в 1953 году в США Уоллесом Коултером (Wallace H.

Coulter).
Первая лабораторная установка для реги-страции флуоресценции потока клеток из первичной суспензии создана в 1968 году Вольфгангом Гёде (Wolfgang Göhde) в Уни-верситете Мюнстера (Германии).
На три года раньше, в 1965 году Марк Фульвейлер (Mack Fulwyler) разработал устройство, позволяющее разделять суспен-зию клеток по их электрическому заряду. Этот методический подход широко исполь-зуется и сегодня.

электрическому заряду:
электростатическое
отклонение
Суспензия
изучаемых клеток
Лазер
Канал
флуресценции
Канал
светорассе-
ивания
Катод (-)
Анод (+)
клетки, -q
клетки,

+q

клетки электронейтральные

цитометр в форме приставки к
флуоресцентному микроскопу фирмы «Zeiss».

С 1970 года в цитометре стали использо-вать гелий-неоновый лазер с излучением, λ = 633 нм. («Cytograph»). Этот прибор позволял быстро разделить изучаемую суспензию клеток на живые и погибшие клетки по вклю-чению в погибшие клетки красителя трипа-нового синего. Позже прибор был усовершен-ствован благодаря использованию аргоно-вого лазера, λ = 488 нм. («Cytofluorograph»).

международной
конференции «The Conference of the American
Engineering Foundation in

Pensacola, Florida» в
1976 году.
С тех пор этот термин утвердился во всем
мире.

Иногда можно встретить термин проточная цитофлуориметрия.
Этот термин не корректный, поскольку одно-
временно измеряется не только флуоресцен-
ция, но и интенсивность рассеянного светово-го потока.

суспензии клеток в диапазоне их разме-
ров от 0,2 до 150

μm.

Преимущества метода проточной цитометрии:
Короткое время анализа (за счет высокой скорости
движения клеток по капилляру, до 1000 клеток/с);
2. Анализ большого количества клеток (до 108 клеток);
3. Высокая точность измерения интенсивности флуо-
ресценции и светорассеивания.

Образцами являются: костный мозг, ликвор, сустав-ная, плевральная или асцитическая жидкости, а также суспендированные клетки крови и различных тканей.

параметров клетки: размер, содержание ДНК, белков (цитокинов, транскрипционных факоров) и

липидов, антигенные свойства и активность фермен-тов, а также возможны исследование клеточного цикла, мониторинг состояния вирусного процесса, количественный анализ внутриклеточных компонен-тов и количественные измерения путем дифференци-ровки интенсивности рассеяния / флуоресценции при различных длинах волн.

анализ.
Это позволяет минимизировать необходимый объем биологического материала (до

100 мкл), сни-зить время пробоподготовки и фактического анали-за, сокращая тем самым, путь от получения образца до клинической интерпретации результата – ответа лаборатории клинике.

лазера одновременно:
1. Рассеивается клетками: малоугловое (пря-мое) светорассеивание (угол

ок. 10о, если
Ø клетки ≈ λ) и боковое светорассеяние (угол ок. 90о, если Ø клетки < λ). Интенсивность светорассеяния измеряют с помощью фотометрического оптического канала.
2. Возбуждает флуоресценцию: собственная (аутофлуоресценция) и после предвари-тельной обработки клеток одним или несколь-кими флуоресцентными красителями, либо МКА, конъюгированными с молекулой флуо-рохрома. Интенсивность флуоресценции измеряют с помощью флуоресцентного опти-ческого канала.

потока, образующихся при
пересечении клеткой лазерного луча
Флуоресценция может быть, как

собственная (аутофлуоресценция),
так и за счёт обработки клеток
различными специальными флу-
оресцентными красителями.

изучаемой суспензии (гидро-
динамическое фокусирование)
Лазерный луч
Оптическая система
Датчики, преобразующие
световые потоки в
электрические

импульсы

Компьютер

Поток клеток

Поток рассеяного света

флуоресценция

струя
в струе
Изотоничный
и забуференный
солевой раствор
Суспензия изучаемых
клеток

по-
тока 30 м/с
Луч лазера
(сфокуси-
рованный)


флуоресценция
светорассеивание
Датчик для измерения
интенсивности
флуоресценции

Датчик для измерения
интенсивности
рассеянного

света

1. Устройство для формирования
ламинарного потока изучаемых клеток:
гидродинамическая фокусировка – струя
в струе

Прошедший световой поток

ФЭУ

ФЭУ

Измерение интенсивности рассеянного клетками светового потока от лазера позволяет:
а). сосчитать

клетки;
б). определить их размер (по прямому / малоугло-
вому светорассеиванию;

Чем больше размер
клетки (диаметр), тем
сильнее будет свето-
рассеивание.

светорассеивание
лазерного луча клеткой

клеток
Размер клеток, μm

окраски клеток флуорес-
центными красителями, позволяет выделить все

клеточные субпопуляции лейкоцитов (в основ-
ном, по степени гранулярности их цитоплазмы):
лимфоциты, моноциты и гранулоциты.

Нейтрофилы

Моноциты

Лимфоциты

Прямое светорассеивание

Боковое светорассеивание

Частотная гистограмма распреде-ления:
по «Х» - шкала интенсивности;
по «У» - к-во клеток с данным зна-
чением параметра

Получение двумерной
диаграммы из двух
одномерных диаграмм

(одномерный график на основе измерения
бокового светорассеивания):
Нейтрофил
(

)

лимфолейкозом (двумерная диаграмма)
Прямое светорассеивание
Боковое светорассеивание
Популяция
злокачественных
клеток

клеток, так и пос-
ле их предварительного окрашивания флуресцент-

ым(и) красителем(ями).

В настоящее время синтезированы флуоресцен-тные красители, которые имеют максимумы возбу-ждения в диапазое λ 400 - 650 нм. Их флуоресцен-ция (вторичный световой поток) имеет определен-ную длину волны. Часто изучаемые клетки окраши-вают сразу несколькими красителями. Как резуль-тат – флуоресценция (вторичный световой поток)
является полихромным. Оптический канал позво-
ляет выделить из общего потока флуоресценции все его составляющие (каждый из которых имеет определенную длину волны) и измерить их интен-сивность.

обработаны изучаемые клетки
Полихромный
флуоресценцентный
световой поток
Прямое
светорассеяние

nm), тетраме-тил-родамин (TRITC), фикоэритрин (PE, λфлуор.= 585 nm), белок хлорофилла

– перидинхлорофилл протеин (PerCp, λфлуор. = 650 nm), алло-фикоцианин (АРС, λфлуор.= 661 nm), тандем цианин-5/фикоэритрин (Cy5/PE,
λфлуор.= 670 nm) и др.
Наиболее распространенным является использо-вание 2 - 4-х флуоресцентных меток (при наличии нескольких лазеров в приборе). Возбужденные лазерным лучом флюоресцентные красители, генери-руют вторичные световые потоки (имеющие различ-ные λ = различные цвета), что позволяет определять 2 или 3 антигена одновременно.

Флуоресцентные красители для обработки
клеток (иммунофлуоресцентное мечение)

флуоресцентных красителей
для проточной цитометрии

с экспрессией соответствующих
антигенов на поверхности, связывают
эти МКА и

начинают флуоресцировать.

Принцип выявления клеточных
маркёров с помощью меченых
флуорохромами моноклональ-
ных антител (МКА)

различных пигментов (хлорофилл);
2. Сортировка клеток по содержанию ДНК и

РНК, в том числе
изучение фаз клеточного цикла;
3. Определение количества копий ДНК в клетке;
4. Сортировка клеток по содержанию РНК;
5. Изучение структуры хромосом;
6. Изучение экспрессии белков и их локализацию;
7. Сортировка клеток по содержанию в них трансгеных продуктов
(белок зеленой флуоресценции – green fluorescenece protein)
и др.);
8. Изучение внутриклеточного содержания цитокинов или вторич-
ных мессенджеров;
9. Выявление клеток, имеющих поверхностные антигены;
10. Измерение ферментативной активности;
11. Определение жизнеспособности клеток;
12. Оценка «дыхательного взрыва» макрофагов;
13. Оценка устойчивости опухолевых клеток к хемиотерапевти-
ческим препаратам и др.

их флуоресценции после окрашивания флуресцентными красителями – получил название
FACS analysis

(fluorescence activated cell sorting).

Меченые различными флуор-
охромами МАК связываются со
«своими» поверхностными
антигенами. В итоге:
CD80+ клетки дают красную
флуоресценцию;
CD14+ клетки – зелёную флуо-
ресценцию.

CD80
CD14 маркер клеток миелоидного ряда
(макрофагов), распознающих бактериальный ЛПС
СD80 –

маркер активиро-
ванных В-клеток

клеток по интенсивности

флуоресценции

определенной
интенсивностью флюоресценции

цитометрии с применением ФИТЦ и PI
Аннексин V – белок с

высоким сродством к фосфатидилсерину.
Используют конъюгат Аннексин V-ФИТЦ.
Propidium Iodide (PI) – флуоресцентный краситель, связывающий-
ся с ДНК или её фрагментами.

Аннексин V-ФИТЦ

Фосфатидилсерин
(ФС)

Экстернализация ФС –
- сигнал для макрофагов:
«ешь меня»

клетки
Апоптозные
клетки
Мёртвые
клетки
Суммарный % апоптозных
и мёртвых клеток

и гематологии. Метод используют для решения следующих задач:
 иммунофенотипирования лимфоцитов, включая

определение
количества CD4, CD8 клеток и даже ТН1 и ТН2 (по продукции
специфических цитокинов);
анализа процессов клеточной активации на основе определения
маркеров ранней активации: CD25 (рецептор интерлейкина-2),
CD38, CD69, CD71 (трансферриновый рецептор), CD95 (антиген
апоптоза), CD122, анти-HLA-DR;
 определения маркеров пролиферативной активности клеток
иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3);
оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными
клеточными популяциями;
 иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом;
 анализа клеточного цикла с определением распределения кле-
точной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия);
анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1,
CD95L, Bcl-2, P53).

ционных факторов);
Определение пролиферативной активности ;
Исследование клеточного цикла;
Оценка клеточной цитотоксичности;
Трансплантационный мониторинг.
Онкология
Количественный анализ

внутриклеточных компо-
нентов (ДНК);
Анализ стадий клеточного цикла;
Определение специфических маркеров;
Наблюдать пациентов, входящих в группу риска;

субпопуляций лимфоцитов);
Оценка функциональной состоятельности иммуно-
компетентных клеток (NK тест,

фагоцитарный тест
и т. п.).
Цитология
Определение цитоморфологических характеристик
клетки: размер, соотношение ядро/цитоплазма,
степень асимметричности и гранулярности клеток;
Оценка активности внутриклеточных ферментов с
помощью флуорогенных субстратов;
Определение экспрессии поверхностных антиге-
нов;
Анализ стадий клеточного цикла;

Ca2+,
потенциал клеточной мембраны).
Гематология
Анализ субпопуляционного состава клеток

крови;
Подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по
специфическим маркерам;
Диагностика и дифференциальная диагностика
лимфопролиферативных заболеваний;
Диагностика острых лейкозов.
Клеточная биология, биохимия
Измерение экспрессии маркеров;
Измерение активности внутриклеточных фермен-
тов;
Определений стадий клеточного цикла при изуче-
нии механизмов действия БАВ на клеточном
уровне.

день может быть ограничено только фантазией исследователя, а в диагностической

службе – аналитическими потребностями клиники.