Слайд 2План лекции
Ферменты – биологические катализаторы. Отличительные признаки ферментативного и химического
катализа. Специфичность
Природа катализа, теории ферментативного катализа
Классификация и номенклатура ферментов
Строение ферментов
(активный и аллостерический центры)
Коферменты и кофакторы. Роль витаминов
Кинетика ферментативных реакций
Ингибирование ферментативных реакций
Регуляция активности ферментов
Принципы энзимодиагностики
Применение ферментов в медицине
Слайд 3Определение
Катализаторы – это вещества, которые влияют на скорость химической реакции,
но сами при этом не расходуются.
Ферменты, или энзимы, -
это биологические катализаторы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах.
По своему химическому строению почти все ферменты являются белками.
Каталитически активные рибонуклеиновые кислоты называются рибозимами
Слайд 4
Общие свойства ферментов и небиологических катализаторов
1) не входят в
состав конечных продуктов реакции и не тратятся в процессе катализа,
выходят из реакции в неизменном виде.
2) ускоряют реакции, не противоречащие законам термодинамики.
3) не смещают положение равновесия, а лишь ускоряют его достижение.
Слайд 5Отличительные признаки ферментативного катализа:
Скорость ферментативного катализа выше, чем небиологического.
Ферменты
обладают узкой избирательностью – специфичностью, действия на субстраты.
3) Ферментативные
процессы не дают побочных реакций, для них характерен 100% выход продукта.
4) Ферменты катализируют реакции в мягких условиях: при обычном давлении, небольшой температуре и значениях рН, близких к нейтральным.
5) Активность ферментов регулируется – они могут изменять свою скорость под воздействием ряда факторов, обеспечивая скоординированность всех метаболических процессов во времени.
Слайд 6Специфичность действия
Под субстратной специфичностью понимают способность фермента взаимодействовать с одним
или несколькими определенными субстратами
Различают:
абсолютную специфичность (глюкокиназа)
относительную (или групповую) специфичность
(пепсин)
cтереохимическую специфичность: например, глюкозооксидаза окисляет только β-D-глюкозу
Слайд 7Процесс катализа можно представить следующим уравнением:
E + S ⇆ [ES]
→ [EР] → E + P
Стадии ферментативной реакции:
Сближение фермента
и субстрата: E + S
Стабилизация переходного состояния: [ES]
Каталитическая реакция – превращение субстрата в продукт реакции –
[EР] → E + P
Слайд 8Стабилизация катализатором переходного (самого нестабильного по ходу реакции) состояния
Слайд 9Энергетический механизм ферментативной и неферментативной реакции
Катализ приводит к ускорению достижения
равновесия за счет снижения энергии активации (Еа), часто ступенчато.
Слайд 10Природа катализа
В реакцию вступают молекулы, преодолевшие энергетический барьер и обладающие
энергией активации Еа
В переходном состоянии [ES] происходит перераспределение химических
связей и образование продуктов реакции.
Природа ферментативного катализа состоит в том, что ферменты с термодинамической точки зрения ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации.
Энергия активации – это та минимальная энергия, которая необходима для того, чтобы произошла химическая реакция, т.е. энергетический барьер преодолевают молекулы, обладающие энергии активации
Слайд 11Теории ферментативного катализа
Образование фермент-субстратного комплекса согласно теории Э. Фишера «ключ-замок».
Изменения
структуры активного центра фермента, вызванныесубстратом, согласно модели «индуцированного соответствия» Д.
Кошланда. Доказано рентгеноструктурным анализом, ЭПР и ЯМР
Слайд 12
Индуцированное соответствие при функционировании гексокиназы (подтвеождение гипотезы Д. Кошланда)
Слайд 13Классы ферментов
Оксидоредуктазы
Трансферазы
Гидролазы
Лиазы
Изомеразы
Лигазы
Слайд 14Название ферментов
В соответствии с классификацией ферментов каждый фермент получил систематической
название:
название субстратов (через двоеточие), название типа химического превращения и
окончания -аза). Например, лактатдегидрогеназа будет иметь систематическое название «L-лактат:NAD+ оксидоредуктаза»
На практике используют рабочие названия ферментов, которые состоят из названия субстрата, типа реакции и окончания «-аза». Например: ЛАКТАТ + ДЕГИДРОГЕНизация + АЗА = ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА.
Некоторые ферменты сохранили исторически сложившиеся тривиальные названия, например УРЕАЗА, ПЕПСИН
Слайд 15Оксидоредуктазы
катализируют реакции окисления-восстановления:
Лактатдегидрогеназа (LDH, EC 1.1.1.27) катализирует превращение
молочной кислоты (лактат) в пировиноградную (пируват) и наоборот:
СН3СН(ОН)СООН + NAD+
↔ CH3COCООH + NADH + H+
Слайд 16Трансферазы
Катализируют реакции переноса групп с одной молекулы на другую
Холинацетилтрансфераза, ЕС
2.3.1.6, (систематическое название
ацетил-КоА: холин О-ацетилтрансфераза)
СH3CO-S-KoA + HO-СН2-СН2-N+(CН3)3 → КоА-SH
+ СН3СОO-СН2-СН2-N+(CН3)3
Слайд 17Гидролазы (фосфатазы, эстеразы, фосфолипазы)
Катализируют реакции разрыва связей с присоединением
воды
Дипептидаза расщепляет дипептид на две аминокислоты при участии воды:
H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R')-COOH
+ H2O→H2N-CH(R)-COOH + NH2-CH(R')-COOH
Слайд 18ЛИАЗЫ (альдолазы, гидратазы-дегидратазы, синтазы, декарбоксилазы)
Катализируют реакции
разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления):
Пируватдекарбоксилаза (ЕС
4.1.1.1, 2-кетокислоты карбокси-лиаза) катализирует расщепление пирувата до уксусного альдегида с отщеплением СО2:
CH3COCООH → CH3COH + СО2
Слайд 19ИЗОМЕРАЗЫ
(рацемазы, эпимеразы, мутазы)
Катализируют реакции, связанные с
изменением строения внутри одной молекулы
Глюкозо-6-фосфат-изомераза (ЕС 5.3.1.9, D-глюкозо-6-фосфат кето-изомераза) превращает
глюкозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат и наоборот:
Слайд 20Лигазы
Катализируют реакции присоединения с образованием ковалентной связи. Реакции ферментов этого
класса необратимы и протекают с использованием энергии АТФ.
Аспартат-синтетаза (ЕС 6.3.1.1,
L-аспартат: аммиак-лигаза синтезирует аспарагин из аспарагиновой кислоты и аммиака:
Слайд 21Номенклатура ферментов
По классификации ферментов (КФ- русскоязычная, ЕС-англоязычная) каждый фермент (энзим)
имеет свой определенный код, состоящий из четырех цифр, разделенных точками.
Первая цифра обозначает класс фермента, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая означает номер фермента.
Слайд 22Подклассы ферментов
Внутри каждого класса происходит разделение на подклассы:
EC 1.1 Действующие
на CH-OH группы донора
EC 1.2 Действующие на альдегидные или оксо-
группы донора
EC 1.3 Действующие на CH-СH группы донора
EC 1.4 Действующие на CH-NH2 группы донора
EC 1.5 Действующие на CH-NH группы донора
Фермент Лактатдегидрогеназа (LDH, EC 1.1.1.27) – это оксидоредуктаза окисляет гидроксильную группу в молекуле лактата, поэтому относится к 1 подклассу:
СН3СН(ОН)СООН + NAD+ → CH3COCООH + NADH + H+
Слайд 23Подподклассы ферментов
Внутри каждого подкласса происходит разделение на подподклассы:
EC
1.1.1 Акцептор NAD или NADP
EC 1.1.2 Акцептор- цитохром
EC 1.1.3 Акцептор-
кислород
EC 1.1.4 Акцептор- сульфид
EC 1.1.5 Акцептор- хинон или подобная группировка
Коферментом Лактатдегидрогеназы (LDH, EC 1.1.1.27) является НАД, поэтому этот фермент относится к 1 подподклассу:
СН3СН(ОН)СООН + NAD+ → CH3COCООH + NADH + H+
Слайд 24Четвертая цифра – номер фермента
Последнее число – номер конкретного
фермента:
EC 1.1.1.1 alcohol dehydrogenase
EC 1.1.1.2 alcohol dehydrogenase (NADP+)
EC 1.1.1.3 homoserine
dehydrogenase
EC 1.1.1.4 (R,R)-butanediol dehydrogenase
... и т. д.
У Лактатдегидрогеназы (LDH, EC 1.1.1.27) 27 порядковый номер в ряду ферментов 1 подподкласса
СН3СН(ОН)СООН + NAD+ → CH3COCООH + NADH + H+
Слайд 25Строение ферментов
По своему химическому строению почти все ферменты являются белками
Активный центр располагается в углублении (в нише) третичной конформации поверхности
фермента
Рис. Субстрат-связывающий карман в сериновых протеазах.
Слайд 26Активный центр
Активный центр фермента – это уникальная комбинация аминокислот, благодаря
которой осуществляется его каталитическое действие.
В активном центре
выделяют 2 домена: «контактный», в котором происходит связывание и ориентация субстрата, и «каталитический», в котором происходит химическое превращение субстрата
Эти 2 домена могут перекрываться
У простых белков-ферментов активный центр образован радикалами аминокислот
У сложных белков-ферментов в активном центре находятся коферменты или кофакторы
Слайд 27Контактная («якорная) площадка обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование
его комплекса с ферментом.
В Каталитическом домене происходит химическое превращение
субстрата
Молекула субстрата также содержит функционально различные участки, подвергающиеся атаке со стороны фермента.
Слайд 28В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные, электростатические (ионные) и гидрофобные
взаимодействия, а также координационные связи
Информация о природе связей между субстратом
и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами УФ- и ИК-спектроскопии
Слайд 29
Активный центр в сериновых протеазах. В каталитическом домене активного центра
выделены Ser195 (оранжевый), His57 (синий) и Asp102 (малиновый), в субстрат-связывающем
домене зеленым изображены NH-группы, образующие оксианионовую дыру, голубым — неспецифическая субстрат-связывающая площадка, и желтым - группы, выстилающие специфический субстрат- связывающий карман.
Гидрофобные и ионные взаимодействия
водородные взаимодействия
Слайд 30Аллостерический центр («Аллос» – другой, «Steros» - пространственный), расположенный вдали
от активного центра, специальный регуляторный центр фермента, с которым связываются
низкомолекулярные вещества – эффекторы, молекулы которых отличаются по структуре от субстратов.
Положительный эффектор ускоряет реакцию
Отрицательный эффектор замедляет реакцию
Ферменты, имеющие аллостерический центр, получили название аллостерических ферментов.
Слайд 31Конформационные перестройки аллостерических ферментов
Аллостерические взаимодействия играют важнейшую роль в контролировании
и интегрировании биохимических реакций.
Менее активная конформация называется Т-cостояние (от
английского tense – напряженное), а более активная – R-состояние (от английского relaxed – расслабленное).
Слайд 32Строение сложных белков-ферментов
Если молекула фермента состоит из белковой части (полипептидная
нить) и небелковой части, то это сложные ферменты.
Белковая часть
фермента, называется апоферментом
Небелковая часть сложного фермента, называется КОФЕРМЕНТОМ или кофактором
Если КОФЕРМЕНТ прочно связан с апоферментом, его называют ПРОСТЕТИЧЕСКОЙ ГРУППОй
Природный комплекс апофермента с кофактором составляет ХОЛОФЕРМЕНТ, т. е. функционально действенный энзим. Соединение в ХОЛОФЕРМЕНТ осуществляется любыми типами связей, кроме ковалентных.
Апофермент синтезируется в организме
Большинство коферментов – это производные витаминов или содержат витамин в качестве компонента
Слайд 33Структура цитохрома Р450
Активный центр простетическая группа
Апофермент
Слайд 34Кофермент – термостабильное низкомолекулярное соединение, небелковая часть сложных белков-ферментов, без
которых фермент не активен
Кофакторы - ионы некоторых металлов (Mg, Zn,
Fe, Сu, Со, Mo и др.), прочно связанные с активным центром
Роль кофакторов – улучшение образования [ES]-комплекса, ориентация субстрата, стабилизация как субстрата, так и активного центра фермента
Слайд 35Функции коферментов
Участие в акте катализа
Осуществление связи между ферментом и субстратом
Стабилизация
апофермента
Апофермент усиливает каталитическую активность небелковой части (КФ и ПГ). Например,
NAD+ является КФ многих дегидрогеназ, отличие - в апоферментной части.
Слайд 36Химическая природа коферментов
К коферментам относят следующие соединения:
Производные витаминов
Гемы, являющиеся простетической
группой цитохромов, каталазы, пероксидазы
Нуклеотиды – доноры и акцепторы остатка Н3РО4
Убихинон,
или коQ
ФАФС – фосфоаденозилфосфосульфат донор сульфата
SAM – S-аденозилметионин донор метильной группы
Глутатион
Слайд 37Витамины – предшественники коферментов
Слайд 38Функция кофермента (по А. Кантарову и Б. Шепартцу).
Слайд 39Изоферменты
Изоферменты(изоэнзимы, изозимы) разные структурные формы ферментов, обладающие каталитической активностью одного
типа; встречаются у организмов одного вида (или в одной ткани).
И. катализируют одну и ту же реакцию, но различаются аминокислотным составом, некоторыми физическими, иммунологическими и каталитическими
Лактатдегидрогеназа имеет 5 изоформ; каждая форма (тетрамер) построена из 4 белковых субъединиц двух типов.
Слайд 40Основы кинетики ферментативных реакций
Кинетика ферментативных реакций – раздел энзимологии, который
изучает зависимость скорости реакции от химической природы реагирующих веществ и
от факторов окружающей среды
Скорость ферментативной реакции определяется изменением количества молекул субстрата или продукта за единицу времени
Кинетика ферментативных реакций определяется образованием фермент-субстратного комплекса:
E + S ⇆ [ES] → [ES] → E + P
Слайд 41Единицы каталитической активности фермента
Каталитическая активность ферментов выражается в каталах и
международных единицах (МЕ):
1 кат – это количество фермента, которое
превращает 1 моль субстрата за 1 сек
МЕ фермента – это количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за 1 мин
1 кат = 6 ∙ 107 МЕ или 1МЕ = 16,67 нкат
Удельная активность фермента – это количество единиц активности фермента в образце ткани, деленное на массу белка в этой ткани
Слайд 42Полный математический анализ ферментативной реакции приводит к сложным уравнениям, не
пригодным для практического применения.
Наиболее удобной оказалась модель ферментативной реакции
первого порядка (один субстрат), разработанная в 1913 году немецким химиком Леонором Михаэлисом (1875-1949) и канадским патологом Мо Ментеном (1879-1960)
Слайд 43Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:
где k1 – константа скорости
образования [ES]
k-1 – константа скорости обратной реакции
k2 –
константа скорости образования продукта реакции
Соотношение констант скоростей называют константой Михаэлиса Кm:
km = (k-1 + k2)/k1
Скорость реакции пропорциональна концентрации [ES]
А скорость образования [ES] зависит от концентрации [S] и концентрации [Е]
Наибольшая скорость реакции наблюдается, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом
Слайд 44Уравнение Михаэлиса- Ментен
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается
следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях
по ферментативной кинетике)
V = Vmax•[S]/(Km+[S])
В этом уравнении Vmax и Km не зависят от концентрации субстрата и характеризуют свойства фермента – они являются кинетическими характеристиками эффективности фермента
Vmax – дает характеристику каталитической активности фермента, имеет размерность моль/л и определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата
Km – характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является постоянной величиной. Константа Михаэлиса измеряется в моль/л и бывает от 10-2 до 10-7, чем меньше Кm, тем активнее фермент.
Слайд 45График уравнения Михаэлиса-Ментен
График зависимости начальной скорости от концетрации субстрата для
аллостерических ферментов имеет сигмоидный характер
Слайд 46Определение Vmax и Km
При [S] < < km
V =
Vmax•[S]/km = k •[S], т.е. при очень низких [S]
скорость
прямо пропорциональна концентрации субстрата
При [S] = km
V = Vmax•[S]/(•[S]+[S]) = Vmax/2, т.е. km равна
концентрации субстрата при половине
максимальной скорости
При [S] > > km
V = Vmax•[S]/(Km+[S]) = Vmax•[S]/[S] = Vmax, т.е.
при очень высоких [S] скорость является
максимальной и не зависит от [S]
Слайд 47
Определение Vmax затруднительно по асимптоте.
Для устранения этого неудобства ЛАЙНУИВЕР
и БЭРК приравняли обратные зависимости левой и правой частей уравнения.
Это уравнение прямой линии: у = ах + b
Графическое выражение для скорости реакции в координатах Лайнуивера-Бэрка имеет вид прямой линии, отсекающей на оси Х значение -1/Km, а на оси Y- значение 1/V max:
Слайд 48
Термолабильность ферментов
Температурный коэффициент Q10 показывает во сколько раз
ускоряется скорость реакции при повышении температуры на 100С
При 1000С почти
все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляют, очевидно, только один фермент мышечной ткани - миокиназа, которая выдерживает нагревание до 1000С), так как происходит денатурация белка
При низких температурах (00С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля (снижается кинетическая энергия - ЕА).
На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.
Слайд 49Кислотность среды особенно важна для аминокислот активного центра: наличие или
отсутствие зарядов, т.е. степень ионизации, влияет на образование фермент-субстратного комплекса,
на способность фермента к связыванию субстрата.
Слайд 50Зависимость активности
ферментов от рН среды
рН-оптимум действия ферментов лежит в
пределах физиологических значений. Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2.0.
Влияние изменений рН среды на молекулы фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина и др.).
При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или в неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно формировании активного фермент-субстратного комплекса.
-СООН АСП или ГЛУ при рН<7 будет нейтральной, а при рН>7 имеет «-» заряд
-NH2 АРГ, ГИС, ЛИЗ при рН<7 будет имеет «+» заряд, а при рН>7 будет нейтральной
Кроме того, имеет значение и состояние ионизации субстратов и кофакторов.
Слайд 51Ингибирование
Ингибирование
Обратимое
Необратимое
Конкурентное
Неконкурентное
Слайд 52Необратимое ингибирование
Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка
(кислоты, щелочи, соли тяжелыхи металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации
фермента.
Необратимое ингибирование неспецифично, оно не связано с механизмами действия ферментов
С необратимым ингибированием связано действие многих токсинов и ядов на организм.
Слайд 53Обратимое ингибирование
Специфические ингибиторы вызывают обратимое ингибирование и поддаются количественному изучению
на основе уравнения Михаэлиса-Ментен.
Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют
на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.
Слайд 54Конкурентное ингибирование
При конкурентном ингибировании ингибитор и субстрат конкурируют между
собой за место в активном центре, стремясь вытеснить один другого
из фермент-субстратного комплекса.
Действие конкурентного ингибитора снимается высокими концентрациями субстрата, при этом Vmax не изменяется, а Кm, увеличивается
Слайд 55Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии
конкурентного ингибитора
Vmax не изменяется, а Кm, увеличивается
Слайд 56Лекарственные препараты как конкурентные ингибиторы
Прозерин и эндрофоний – ингибиторы
холинэстеразы используют при лечении мышечной дистрофии (нейромедиатор ацетилхолин вызывает деполяризацию
мембраны)
Сульфаниламиды – аналоги пара-аминобензойной кислоты являются антиметаболитами
Слайд 57Неконкурентное ингибирование
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с
субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в
другом месте молекулы фермента
Степень торможения определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент.
Неконкурентное ингибирование может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр.
Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента
Слайд 58Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии
конкурентного ингибитора
Vmax уменьшается, а Кm не изменяется
Слайд 59Лекарственные препараты как неконкурентные ингибиторы
Аспирин ингибирует циклооксигеназу
Слайд 60Регуляция активности ферментов
Ковалентная модификация – частичный протеолиз: зимогены - пепсиноген
Нековалентная
модификация: фосфорилирование-дефосфорилирование – гликогенфосфорилаза (фосфорилированная форма активная, дефосфорилированная – неактивная
Ингибирование
– регуляция по принципу обратной связи: конечный продукт ингибирует ключевой фермент: холестерин – ГМГКоА-редуктазу
Репрессия или индукция генов (изменение биосинтеза ферментов): тироксин взаимодействует с гормончувствительным участком ДНК
Компартментализация: ЖК синтезируются в цитоплазме, окисляются в митохондриях (ЦПЭ)
Аллостерическая регуляция
Слайд 61Принципы энзимодиагностики
Концентрация внутриклеточных (тканевых) ферментов в крови увеличивается при поврежден
клеток: АСТ, АЛТ – гепатит; КФК, АСТ, ЛДГ – инфаркт
миокарда
Количество высвобождаемых ферментов достаточно для его обнаружения: АСТ в норме 2-25 МЕ, при гепатитах – 150-1000 МЕ
Активность высвобождаемых ферментов стабильна
Органоспецифичность: ЩФ Регана при раке легких
Слайд 62Применение ферментных препаратов в медицине
При заболеваниях ЖКТ: мезим-форте, фестал, энзистал,
панкреатин
При иммунодефицитах: вобэнзим
Протеолитические ферменты: трипсин, химотрипсин
При тромбозах: урокиназа, стрептолиаза
Для рассасывания
рубцов ( при ожогах): лидаза (гиалуронидаза)
![Процесс катализа можно представить следующим уравнением:E + S ⇆ [ES] → [EР] → E + P Стадии ферментативной](/img/thumbs/eb1a2e10de1c6d947b20007c486b4fa5-800x.jpg "Ферменты Процесс катализа можно представить следующим уравнением:E + S ⇆ [ES] →")
![Природа катализаВ реакцию вступают молекулы, преодолевшие энергетический барьер и обладающие энергией активации Еа В переходном состоянии [ES]](/img/thumbs/29b6ec8fea0c8dc1bf677785eddbc385-800x.jpg "Ферменты Природа катализаВ реакцию вступают молекулы, преодолевшие энергетический барьер и обладающие энергией")
![Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:где k1 – константа скорости образования [ES] k-1 – константа скорости обратной](/img/thumbs/895479ae3784c89a86b92c51b65a526e-800x.jpg "Ферменты Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:где k1 – константа скорости образования")
![Определение Vmax и Km При [S] < < kmV = Vmax•[S]/km = k •[S], т.е. при очень](/img/thumbs/2edaef9f0ee362dfd1805870d081fe2a-800x.jpg "Ферменты Определение Vmax и Km При [S] < < kmV = Vmax•[S]/km")
