ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ELISA

молочных продуктов

крови, молока, растительном соке, культуральной жидкости от микроорганизмов, клеточном гомогенате,

вытяжке из образца почвы, содержащих сотни и тысячи различных компонентов? Возможно, но при одном условии: анализируемый компонент должен обладать свойствами антигена, то есть способностью вызывать в организме человека или животных синтез особых белков – антител, с высокой специфичностью связывающих антиген. Решение таких задач — сфера иммуноферментного анализа (ИФА). Однако предварительно необходимо получить очищенный антиген, соответствующее антитело и подобрать фермент в качестве метки для антитела или антигена.

и количественного измерения антигенов и антител.

между антигеном и соответствующим ему антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием конъюгата,

который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена либо другие пероксидазы).

полисахариды. Это полноценные антигены. Антитела образуются не против всей молекулы

белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности — антигенным детерминантам (эпитопам). Такие участки у белков включают не менее пяти аминокислотных остатков. Антигенные детерминанты разветвленных молекул полисахаридов представлены цепочками из четырех—шести остатков.
Существуют также неполноценные антигены — гаптены. Антитела к гаптенам образуются лишь при их посадке на полимерную матрицу, в качестве которой используются белки, полимеры клеточных стенок бактерий, синтетические полиэлектролиты. Таким способом можно получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным соединениям, стероидным и пептидным гормонам, витаминам, пестицидам.

это мыши, морские свинки, кролики, на производстве овцы, козы, лошади.

Пригодны куры: антитела после иммунизации выделяют из желтков яиц.
Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению.

не одну, а несколько антигенных детерминант, можно представить, какое множество

антител вырабатывается в организме на введение одного антигена. Такие антитела называются поликлональными. Они гете-рогенны по сродству к антигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его генетических особенностей и физиологического состояния.

аффинной хроматографии позволяет очистить белки в 1000 раз и более.

гетерогенности препарата антител. Выход из этого затруднения — в получении

антител с одной специфичностью, реагирующих с единственной антигенной детерминантой. Такие антитела называются моноклональными

и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому размножению, неограниченному числом

делений (в отличие от большинства неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физико-химических свойств.

сохраняет свою активность и обладает высокой специфичностью к субстрату. Широко

используются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и
β-галактозидаза.
Перспективны люциферазы светлячков и светящихся бактерий.
Активность ферментов детектируют по изменению оптической плотности, флуориметрически и электрохимически. Люциферазные реакции сопровождаются высвечиванием фотонов, поэтому их регистрируют по биолюминесценции.

потери активности фермента и нарушения свойств антитела и антигена?
Для

этого существуют три группы методов: биохимические, иммунологические и генноинженерные.

при участии свободных реакционноспособных групп: — NH2, — COOH, —SH,

—OH.
Иммунологические методы получения антигенов или антител, меченных ферментами, основаны на применении антител или их составляющих в качестве сшивающих звеньев.
Генноинженерный метод получения меченого антигена основан на синтезе гибридных белков с помощью микроорганизмов. Таким методом, используя трансгенную E. coli, получены гибридные белки, содержащие полную аминокислотную последовательность бактериальной β-галактозидазы и специфическую последовательность белка от вируса иммунодефицита человека или вируса гепатита B.

воздействие на ферментативную активность комплекса. Такой ИФА может быть реализован

в однофазной системе — в растворе и поэтому называется гомогенным или жидкофазным.

с иммуносорбентом. -
— физическое разделение с помощью твердой фазы, связывающей

меченый реагент. Это гетерогенный или твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используются лунки специальных планшетов из непористых прозрачных полимерных материалов: полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата. Белки (антигены или антитела) адсорбируются на поверхности пластика — и в этом основа твердофазного ИФА. Для увеличения прочности связывания белков пластик подвергается модификации Способ модификации — ноу-хау фирмы-производителя, таким образом, что активированная поверхность приобретает способность к ковалентному связыванию белков. К режиму модификации предъявляются жесткие требования: однородность связывающих свойств поверхности пластика, его оптическая прозрачность (результаты ИФА регистрируются фотометрически). По окончании процедуры связывания с поверхностью пластика несвязанный меченый реагент просто смывается с поверхности планшета.

Избыток Ат смывают буферным раствором. Оставшиеся незанятыми участки связывания на

поверхности полистирола блокируют добавлением постороннего белка, например бычьим сывороточным альбумином; поверхность вновь отмывают. Образец, содержащий антиген Аг в неизвестной концентрации, смешивают с определенным количеством меченого антигена и добавляют к антителам, фиксированным на полистироловой подложке. Аг и Аг—Б конкурентно связываются с Ат. Поверхность полистирола опять отмывают для удаления несвязанных Аг и Аг—Б. После этого определяют активность фермента в лунке полистиролового планшета, которая будет обратно пропорциональна концентрации антигена в исследуемом образце. Это конкурентный гетерогенный ИФА.

(он должен обладать не менее чем двумя валентностями) из тестируемого

образца. Затем добавляют вторые антитела Ат2, сшитые с ферментом Б. После удаления избытка Ат2—Б в лунку полистиролового планшета добавляют субстрат реакции и определяют активность фермента, которая будет линейно зависеть от концентрации Аг в образце.

планшетах можно измерить за одну минуту в 96 лунках. Однако

в целом гетерогенный ИФА продолжительнее гомогенного. Его проведение требует до 3—4 часов, поскольку на каждом этапе операции должно установиться равновесие, и лишь после этого можно провести отмывку иммуносорбента, которая тоже занимает время.

М, белка в микрограммах-нанограммах в 1 мл — это обыденное дело. Подобно

тому как глаз человека регистрирует одиночный световой квант, ИФА можно усовершенствовать так, что он с помощью каскадных систем усиления позволит обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества.