Особенности кинетики аллостерических ферментов

– пространственный.
Аллостерические ферменты – особая категория ферментов,

их функция – регуляция активности метаболических путей («ключевые» ферменты).
Активность аллостерических ферментов регулируется, в основном, с помощью аллостерических регуляторов (активаторов и ингибиторов). Эффект этих регуляторов проявляется чрезвычайно быстро. Возможна также регуляция активности под влиянием концентрации собственного субстрата.

Аллостерические регуляторы не обладают структурным сход-ством с субстратом. Эти регуляторы с высоким сродством нековалентно (обратимо) связываются со специальными сайта-ми, лежащими за пределами активного (каталитического) центра молекулы аллостерического фермента. Регуляторы действуют в низких концентрациях.

Теория аллостерических ферментов была разработана в 1956-1963 гг. Амбуржье, Моно, Шанжё и Жакобом.

белки);
содержат два типа пространственно раз-
деленных связывающих центров:
I тип:

несколько активных (каталитических)
центров – чаще всего по количеству
субъединиц ;
II тип: несколько регуляторных (аллостери-
ческих) центров, предназначенных для
специфического связывания аллостеричес-
ких регуляторов: активаторов и ингибиторов.

основанием для появления термина аллостерический);
не подчиняются кинетике Михаэлис-Ментен. График зависимость

скорости ферментати-вной реакции от концентрации субстрата имеет сигмовидную (S-образную) форму;

одном
каталитическом центре всегда приводит
к увеличению сродства к субстрату

вто-
рого каталитического центра. Это проис-
ходит опосредованно – через изменение
конформации второго каталитического
центра.

Так проявляется кооперативность взаимо-действия между активными (каталитически-ми) центрами в молекуле аллостерического фермента.

было открыто явление кооператив-ности во взаимодействии связывающих О2 центров. Много

позже кооперативность была выявлена для других белков и аллостеричес-ких ферментов.

Кооперативность – согласованное взаимодействие между центрами субъединиц в процессе связывания с ними лигандов, приводящее к изменению сродства лиганда к центру.
Кооперативность широко распространена в живой природе. Она описана при функционировании многих белков и нуклеиновых кислот.

гемоглобина

Степень насыщения участков,
связывающих кислород

(Y), пока-
зана как функция парциального
давления О2 (рО2) в растворе.

Р50 – характеризует сродство к
О2 - это парциальное давление,
при котором насыщены 50%
участков связывания (Y=0,5).


Кривая зависимости имеет типич-
ную сигмоидную форму.

Впервые этот феномен в 1904 г.
описал Кристиан Бор [ Bohr C. (1904)
 Zentralblatt Physiol., 23, 688–690 ].
.

О2 связывается с субъединицами гемо-
глобина в последовательности: 1(α1)?2(α2)?3(β1)?4(β2).

В результате этого меняется конформация следующей
субъединицы, что приводит к увеличению сродства центра
cвязывания в этой субъединице к молекуле О2. В целом
происходит нелинейное нарастание сродства всей моле-
кулы гемоглобина к О2.

О2

О2

О2

О2

концентрации субстрата

Зона максимального
проявления
кооперативности
По мере линейного увеличения [S],

проявление
эффекта (нарастание V реакции) происходит
НЕЛИНЕЙНО – т.е результат всегда больше, чем
простая сумма слагаемых явлений. Причина –
нелинейное увеличение сродства активных
центров аллостерического фермента к субстрату.

На этом участке коперативность
уже не проявляется

каталитическому
превращению, он
действует как
регулятор.
Гетеротропные
ферменты

Аллостерические
регуляторы не являют-
ся субстратами

фермента.

связывания аллостерических регуляторов.

Аллостерические
регуляторы

Положительные
регуляторы – увеличивают
aктивность: при одной

и
той же [S], Km и/или Vmax

Отрицательные
регуляторы – снижают
активность: при одной и
той же [S], Кm и/или Vmax

молекулы фермента, в первую очередь – каталитического центра.

В результате этого меняется сродство субстрата к ферменту ( Кm) или меняется
( Vmax). Возможно и то, и другое одновременно.

Общий механизм действия аллостерических регуляторов

фермента (AS)
субстрат
аллостерический
ингибитор

изменениям скорости ферментативной реакции – основное проявления кооперативности во взаи-модействии

активных центров.

Под влиянием незначительных концен-траций аллостерических регуляторов происходят значительные изменения каталитических свойств аллостеричес-ких ферментов: ΔKm и/или ΔVmax.

реакции от концентрации субстрата – отра-жает явление кооперативного взаимодейст-вия каталитических

центров в составе суб-ъединиц фермента.

+ кооперативность – регулятор повышает сродство фермента к субстрату, активирует фермент.

- кооперативность – регулятор снижает сродство фермента к субстрату, снижает активность фермента.

под влиянием
+ или - аллостерических
регуляторов.


Пример изменения Vmax без

изменения сродства фермен-
та к субстрату под влиянием
+ или - аллостерических
регуляторов.

(ПКА) с помощью цАМФ. Неактивная ПКА – тетрамер: 2 регуляторных

и 2 каталитических субъединицы. цАМФ (аллостерический активатор) связывается со специфическими сайтами на регуляторных субъединицах ПКА, что приводит к диссоциации (особождению) каталитических субъеди-ниц. Они становятся активными и фосфорилируют соответстующие белки–мишени, изменяя их актив-ность.
Ретроингибирование или отрицательная обратная связь. Конечный продукт метаболического пути, явля-ясь аллостерическим ингибитором, снижает актив-ность регуляторных ферментов, расположенных в начале этого пути (АТФ подавляет активность фосфо-фруктокиназы и пируваткиназы гликолиза).

позволяющий количественно оха-рактеризовать степень проявления кооперативности [Hill A.V. (1910)  J.

Physiol., 40]. 

А. Хилл рассматривал процесс в динамике: заполнение центров связывания молекулами лигандов происходит не мгновенно, а последовательно.
Для количественной характеристики этого явления в каждый данный момент времени им было введено понятие степень насыщения (Y):

y
Y =
1-y

Степень насыщения (Y) – отношение числа
центров, связавшихся с лигандом (у), к числу
центров, оставшихся свободными (1-у).
Y = 0, если все центры свободны; Y = 1, когда
все центры заняты.

k1
E + nS E(S)n
k2
n – число центров, связывающих S

k1 [E][S]n = k2 [E(S)n]

k1 [E][S]n
[E(S)n] =
k2
k1
= K , то: [E(S)n] = K [E][S]n
k2

субстрата, Хилл предложил эмпирическое уравнение:

K [S]n
Y = -
1+K[S]n


Если все участки связывания заняты молекулами S
(случай насыщения), то уравнение примет вид:

Y = K [S]n

для случая частичного
заполнения участков

Y – степень заполнения активных центров молекулами
субстрата

y
поскольку Y =

1-y

y
= K [S]n
1-y


y
lg = lg K + n х lg[S]
1-y

Логарифмирование уравнения позволяет линеаризовать график

Уравнение Хилла:

, то для случая насыщения:

1-y


наклон = n (tgα)
Чем больше величина

n,
тем больше кооперативность

α

n – численное представление
степени кооперативности

(зеленая линия)
tgα1 > 1 – при кооперативном связывании;
tgα2 < 1

– при некооперативном связывании.

α1

α2

вид:

v
lg = lg K + n х lg[S]
Vmax-v

v – скорость реакции при данной степени запол-
нения центров (определяется концентрацией
субстрата).
Vmax – максимальная скорость.

были заложены работами ряда исследовате-лей в период с 1955 по

1963 годы: Робертс, Амбуржье, Герхард, Парди, Моно, Жакоб, Шанжё.

или
модель Моно-Уаймена-Шанжё

Постулаты модели:

1. Фермент содержит 2 субъединицы: T или R
2. Т - напряженная конформация, низкое
сродство к S
R- релаксированная конформация,
высокое сродство к S
4. В отсутствии S: T ?? R (равновесие)
5. В присутствие S: T ? R (переход). Связы-
вание первой молекулы S – индукция пе-
рехода T ? R
6. Переход T ? R всегда согласован: 2T ? 2R

Аллост. ингибитор взаимодейств. с T и ста-
билизирует её.
Аллост. активатор взаимодейств. с R и ста-
билизирует её.

2T

2R

S

Постулаты

модели:

Фермент содержит 2 субъединицы, су-
ществующие в двух независимых кон-
формациях: T и R
2. Связывания первой молекулы S ин-
дуцирует переход T ? R только одной
из двух субъединиц
3. Появляется гибридная форма RT
4. Этот процесс изменяет сродство к S
второй субъединицы (+ или -)
5. Связывание второй молекулы S за-
вершает переход обоих субъединиц
в R конформацию.


Отличие модели Кошленда в том, что
переход T ? R происходит не одновре-
менно, а последовательно.

TT

S

RT

RR