З а нятие 5. Тема:Механизмы передачи сигнала:

а) липофильных гормонов
(внутриклеточные рецепторы)

б) гидрофильных гормонов
(внеклеточные рецепторы)
3) Рецепторы цитокинов
4) Сигнальные пути

молекула, адресно передающая
информацию от клетки к клетке

Гормон
от греч. ὁρμάω (лат. harmao) — возбуждаю
биологически активные вещества органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках желёз внутренней секреции, поступающие в кровь, связывающиеся с рецепторами клеток-мишеней и оказывающие регулирующее влияние на обмен веществ и физиологические функции.

может иметь неравнозначные синонимы

Лиганд любое органическое химическое соединение, образующее комплекс с какой-либо биомолекулой (чаще с белком, например клеточным рецептором, иногда с ДНК) что вызывает клеточный ответ:
1) биохимический,
2) физиологический или
3) фармакологический

Вторичный мессенджер (вторичный посредник)
(secondary mediator, second messenger)— физиологически активная регуляторная молекула, образующаяся в цитоплазме клеток в ответ на взаимодействие сигнальной молекулы (гормона, нейромедиатора и др.) и участвует в передаче и усилении сигнала внутри клетки.

Терминология

фермента, специфично связывающийся с лигандом (субстратом) по механизму Кошланда.
Терминология
В 1958

американский биохимик Дэниел Эдвард Кошланд (Daniel Edward Koshland) предложил теорию наведенного взаимодействия, согласно которой субстрат и активный центр фермента узнают друг друга путем взаимного изменения конформации друг друга для достижения состояния максимальной конгруэнтности (комплементарности) их внешней электронной оболочки, если таковая достигается, происходит акт катализа, если нет – субстрат будет катализирован более подходящим ферментом.
В процессе взаимоиндукции трехмерной формы у фермента происходит окончательное достраивание активного и каталитического центров до трехмерной конформации, наиболее оптимальной для осуществления акта катализа, а субстрат принимает трехмерную конформацию, максимально удобную для осуществления акта катализа и максимально энергетически невыгодную для связывания реакционно-способной группы атомов (или одиночного атома) с остальной часть молекулы.

данного вида метаболитом поступающее с пищей или используемое как фармакологическое

средство, либо пищевой или промышленный продукт

искусственно синтезированное вещество, используемое как фармакологическое средство, либо пищевой или промышленный продукт

Амины,
Белки,
NO, CO

Дистантного действия

Локального действия
(аутакоиды)

Простагландины,
Тромбоксаны,
Лейкотриены,
Фактор активации тромбоцитов

Белки
Липиды

Гипофизарные, Панкреатические
Натрийуретические пептиды, Гормоны печени, почек
Адипокины

Стероиды,
Ретиноиды,
Тироксин → Т3

Сахара как гормоны ?

или функциональная группа молекул находящаяся на поверхности клетки, клеточных органелл,

или в цитоплазме,
специфически реагирующая изменением своей трехмерной конфигурации в ответ на присоединение к ней определенной (специфичной) молекулы, передающей внешний регуляторный сигнал,
и передающая этот сигнал внутрь
1) клетки,
2) клеточного ядра или
3) другой клеточной органеллы,
непосредственно,
либо при помощи вторичных посредников,
либо меняя трансмембранный ионный поток.

данных функций в клетках органа-мишени;

кинетика связывания лиганда должна описываться кривой с насыщением (график Скэтчарда), то есть, состоянием полной занятости медиатором всех молекул рецепторов, число которых на мембране мало и ограничено;
связывание лиганда и его клеточный (физиологический) эффект должны быть:
обратимы,
параметры сродства должны соответствовать физиологическим концентрациям лиганда.

Чтобы быть рецептором молекулы белков должны отвечать ряду требований:

рецепторные системы, процесс функционирования которых включают реализацию следующих стадий:
связывание первичного

мессенджера с рецептором;
передачу информации о связывании внешней сигнальной молекулы с рецептором на мембранные или цитоплазматические белковые компоненты каскада;
формирование первичного и вторичного клеточного ответа.

См. следующий слайд

Мембранные рецепторы и механизм действия гидрофильных посредников

(медиатор, стимул) взаимодействует с клеточным рецептором,
2) это активирует эффекторную молекулу,
3)

которая образует молекулы вторичных посредников,

4) которые активируют цитоплазменные белки-мишени (обычно каскадная цепь протеинкиназ числом до семи), вызывающих генерацию последующих посредников,

5) посредники и внешний агент исчезают.

клеток-мишеней.
В крови липофильные гормоны обычно связаны со специфичным для данного

гормона транспортным белком, образуя комплекс белок-гормон.
При встрече комплекса с плазматической мембраной клетки-мишени гормон высвобождается и свободно диффундирует через мембрану в цитоплазму, далее либо проникает

стероидные гормоны:
холекальциферолы
половые стероиды
глюкокортикоиды
минералокортикоиды

тироксин

ретиноевая кислота и ее производные (ретионоиды)

в цитоплазму, где гормон взаимодействует со специфическим рецептором и виде комплекса гормон-рецептор проникает в ядро

сразу в ядро клетки, где гормон взаимодействует со специфическим рецептором и виде комплекса гормон-рецептор

где изменяет процесс считывание генома

клетках-мишенях в количестве 10−3 – 10−4 молекул на клетку и

вместе с тем характеризуются высоким уровнем сродства к гормону (Кd = 10−8 – 10−10 М) и высокой избирательностью.
связывание гормона вызывает последовательный ряд событий
1) конформационную перестройку молекулы рецепторного белка, 2) конформационную перестройку молекул сопряженных с ним субмембранных белков,
3) их диссоциацию с освобождением от белков-ингибиторов, в частности от белка теплового шока (hsp90),
4) образование димеров, обладающих высоким сродством к ДНК,
5) связывание димеров гормон-рецепторного комплекса с двунитевой ДНК – ключевая стадия процесса гормональной регуляции,

элементы (ГРЭ (HRE)).
7) ГРЭ – короткие симметричные фрагменты ДНК (палиндромы),

выполняют функцию усилителей (энхансеров, англ. enhancer – усилитель) транскрипции.
8) ГРЭ разных гормонов различаются несколько иной нуклео-тидной последовательностью, что существенно важно для сохранения специфичности гормонального действия.

Каждый гормон-рецепторный комплекс узнает собственный участок связывания и инициирует транскрипцию лишь одного контролируемого этим участком гена.

Связывание димеров рецептора с ГРЭ стимулирует, реже ингибирует, транскрипцию соседних генов.

Таким образом, гормон в течении нескольких часов изменяет уровень специфических мРНК ключевых белков клетки.

комплекса гормон-рецептор
Экспрессия (активация) генов
Репрессия (ингибирование) генов
Индукция синтеза белка
Репрессия синтеза белка
Изменение

количества белков (ферментов)

Механизм действия липофильных гормонов

Связывание гормона с рецептором

в цитоплазме

в ядре

Взаимодействие с ДНК

семей-ству белков;
2) образованы несколькими белковыми доменами, имеющими различные размеры и

выполняющими разные функции;
3) в рецепторе имеются А) регуляторный, Б) ДНК-связываю-щий, В) небольшой сайт-специфичный и Г) гормон-связываю-щий домены.
Наибольшая степень гомологии между липофильными рецепторами наблюдается в области ДНК-связывающего домена. Здесь содержатся повторяющиеся фрагменты, богатые остатками цистеина. Цистеин координационно связывает ионы цинка и образунт цинковые кластеры.

Remec Pavlin
College Scholars: Biophysics
Mentor: Elias J. Fernandez, BCMB Spring 2014

сворачиваться в трехмерные глобулы. Он присоединяется к белковым молекулам и

сжимает их, как тисками, используя для этого энергию АТФ. Это приводит к тому, что рецептор не может выполнять свою функцию. Высвобождение Hsp90 из связи с эстрогеновым рецептором вызывает димеризацию рецептора, то есть, переход его в активную форму.

Нуклеотидная последовательность AGGTCA сокращенно называется ERE (oestrogen response element)

других тиреоидных гормонов),
ретиноевой кислоты,
вирусный и клеточный онкоген erb-A,
диоксина (экологически

опасный токсин)
и множество других белков, лиганды которых пока не идентифицированы.

обладающие свойством связываться с рецепторами.
Например, синтетическим путем получены оральные

контрацептивы, агонисты эстрогенов и прогестерона.

Синтетические лиганды, вызывающие тот же эффект, что и природные гормоны, называются агонистами гормонов.
Лиганды, которые связываются с рецептором, но не вызывают биологического эффекта, называют антагонистами, т. е. антагонисты блокируют действие эндогенных гормонов.

Антагонисты гормонов применяют в терапии опухолей.
Для того чтобы оценить, является ли данная опухоль гормонозависимой и будет ли она чувствительна к действию антагонистов, необходимо на пробе ткани определить уровень экспрессии гормональных рецепторов.

проходить через липофильную клеточную мембрану.

Поэтому передача сигнала в клетку

осуществляется через мембранные рецепторы (проводники сигнала).

Данным сигналом определяется транскрипция определенных генов и активность ферментов, которые контролируют обмен веществ и взаимодействуют с цитоскелетом.

третьего типа, сопряженные с ГТФ-связывающими белками

аллостерические ферменты, активный центр которых расположен на внутренней стороне мембраны
многие

из них являются тирозиновыми протеинкиназами

К этому типу принадлежат рецепторы инсулина, ростовых факторов и цитокинов.

это активирует фермент и фосфорилирование остатков тирозина в ряде белков

(в первую очередь фосфорилируется молекула рецептора (автофосфорилирование)
3) с фосфотирозином связывается SН2-домен белка-переносчика сигнала, функция которого состоит в передаче сигнала внутриклеточным протеинкиназам.

мембранными белками, образующими лиганд-активируемый ионный канал
связывание лиганда ведет к открыванию

канала для Na+, К+ или Cl−.

По такому механизму осуществляется действие нейромедиаторов, таких, как ацетилхолин (никотиновые рецепторы: Ca++-, Na+- и К+-каналы) и γ-аминомасляная кислота (ГАМКА-рецептор: Cl −-канал).

белков включает семь трансмембранных тяжей, проникающих через клеточную мембрану
такие рецепторы

передают сигнал с помощью ГТФ-связывающих белков на белки-эффекторы, которые являются сопряженными ферментами или ионными каналами
функция этих белков заключается в изменении концентрации ионов или вторичных мессенджеров.

из трех вариантов внутриклеточного ответа:

рецепторные тирозинкиназы активируют внутриклеточные

протеинкиназы,

2) активация лиганд-активируемых ионных каналов меняет концентрации ионов, 

3) активация рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками, индуцирует синтез веществ-посредников – вторичных мессенджеров

(сАМР) активирует протеинкиназу А [ПК-А (PK-A)],

вторичный мессенджер диацилглицерол [ДАГ

(DAG)] активирует протеинкиназу С [ПК-С (PK-C)],

вторичный мессенджер инозитол-1,4,5-трифосфат [ИФ3 (InsP3)] увеличивает концентрацию Са2+ в цитоплазме клетки.

клеточной адгезии

Фермент зависимый рецептор
Молекулы клеточной адгезии

транспортер
Вторичный мессенджер
Протеинкиназы и фосфатазы
ДНК

промотеры
Структуры ДНК
компонентов

Ядерный рецептор

Ядро

Органеллы

Цитоскелет

Мембрано-связанные
лиганды

Тип 1

Тип 2

Тип 3

на белки-эффекторы.

построены из трех субъединиц: α, β и γ.


проявляют слабую ГТФ-азную активность и похож на другие ГТФ-связывающие белки, такие, как ras и фактор элонгации Tu (EF-Tu)

связаны с ГДФ в неактивном состоянии.

α-cубъединица обладает свойством связывать гуаниновые нуклеотиды [ГТФ (GTP) или ГДФ (GDP)].

сигнального вещества с рецептором третьего типа меняет его конформацию так,

что рецептор связывает G-белок

2) связывание G-белка с рецептором высвобождает ГДФ, на место которого α-субъединице встает ГТФ в (1) (см. следующий слайд)

3) в результате G-белок активируется, отделяется от рецептора и диссоциирует на α-субъединицу и комплекс из β-, γ-субъединиц

4) ΓТΦ-α субъединица связывается с белками-эффекторами и изменяет их активность, в результате чего происходит открывание или закрывание ионных каналов, активация или ингибирование ферментов (3, 4, 5) и изменение активности генома (6). (7) – удаление сАМР фосфодиэстеразой (ФДЭ) (см. следующий слайд).

element-binding protein) — транскрипционный фактор. Он связывается с определёнными последовательностями ДНК, которые называются CRE (cAMP

response elements), регулируя (усиливая или ослабляя) транскрипцию соответствующих генов.
CREB впервые описан в 1987 г как цАМФ-зависимый транскрипционный фактор, регулирующий работу гена соматостатина.

1

2

3

АТФ

4

7

5

6

α-субъединицу в неактивное состояние

и она вновь связывается с β, γ-комплексом, т.е. G-белок возвращается в исходное состояние 1).

Таким образом, работа рецептора третьего типа может быть представлена как цикл биохимических реакций.

мембранного рецептора на исполняющие внутриклеточные белки (чаще протеинкиназы).

Их концентрация строго

контролируется гормонами, нейромедиаторами и другими внеклеточными сигналами.

Они образуются из доступных субстратов и имеют короткий биохимический период полужизни.

Наиболее важными вторичными мессенджерами являются цАМФ (сAMP), цГТФ (cGTP), Са2+, инозитол-1,4,5-трифосфат [ИФ3 (lnsP3)], диацилглицерол [ДАГ (DAG)] и монооксид азота (NO).

– семей-ством ферментов, катализирующих реакцию циклизации АТФ (АТР) с образованием

цАМФ и неорганического пирофосфата. (см. следующий слайд)

Расщепление цАМФ с образованием АМФ (AMP) катализируется фосфодиэстеразами, которые ингибируются высокими концентра-циями производных метилксантина, например кофеином.

Активность аденилатциклазы контролируется G-белками, сопряженными с рецепторами третьего типа, управляемыми внешними сигналами.

Большинство G-белков (Gs-белки) активируют аденилатциклазу, некоторые G-белки ее ингибируют (Gi-белки). Некоторые аденилатциклазы активируются комплексом Са2+/кальмодулин.

каналов.

В неактивном состоянии ПК-Α является тетрамером, две каталитические субъединицы (К-субъединицы)

которого ингибированы регуляторными Р-субъединицами (аутоингибирование).

При связывании цАМФ Р-субъединицы диссоциируют из комплекса и К-единицы активируются.

Фермент может фосфорилировать остатки серина и треонина, находящиеся в ключевых положениях в цепи, в более чем 100 различных белках, в том числе во многих ферментах и факторах транскрипции.

В результате фосфорилирования изменяется функциональная активность этих белков. (см. слайд 39)

фосфоинозитолдифосфат, инозитолтрифосфат, диацилглицерол (ДАК), все соединения различаются по метаболизму и

механизму действия.
На рис. показан механизм с участием фосфоинозитолдифосфата

цАМФ
Стимулирующий внешний сигнал
Ингибирующий внешний сигнал
Форскалин
Включение
Колюшный токсин
Включение
Выключе-
ние
ГДФ
Холерный токсин
Фн
Клеточный ответ
Фосфодиэстераза

ГДФ

цАМФ + П-киназа  R-цАМФ + С

Выключение

АМФ

Теофиллин
Кофеин

Белок неактивен

Белок-Р активен

––

–

–

+

–

ГТФ

АТФ

––

ГТФ

––

Rs

Ri

Gi

AC

Gs
ГТФ

+

Пояснения см. на следующем слайде

— тормозный рецептор,
Gs — возбуждающий G-белок,
Gi — тормозный G-белок,
ГТФ —

гуанозин-трифосфат,
АТФ — аденозитрифосфат,
ГДФ — гуанозиндифосфат,
АC — аденилатциклаза,
АМФ — аденозинмонофосфат,
цАМФ — циклический аденозинмонофосфат,
Фн — неорганический фосфат
На схеме показаны также фармакологические препараты и токсины, которые запускают (+) или ингибируют (—) некоторые реакции.

низка (10-100 нМ).

Низкий уровень поддерживается кальциевыми АТФ-азами (кальциевыми насосами)

и натрий-кальциевыми обменниками.

Резкое повышение концентрации Са2+ в цитоплазме (до 500-1000 нМ) происходит в результате открывания кальциевых каналов плазматической мембраны или внутриклеточных кальциевых депо (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума).

нейромедиаторов (глутамат и АТФ), вторичных мессенджеров (ИФ3 и цАМФ), а

также вещества растительного происхождения – рианодина.



В цитоплазме и клеточных органеллах имеется множество белков способных связывать Са2+, некоторые из них выполняют роль буфера.

При высокой концентрации в цитоплазме Са2+ оказывает на клетку цитотоксическое действие. Поэтому [Са2+]в отдельной клетке испытывает кратковременные всплески, увеличиваясь в 5-10 раз, а стимуляция клетки увеличивает лишь частоту этих флуктуаций.

тропонин.

Кальмодулин — сравнительно небольшой белок (17 кДа) — присутствует во

всех животных клетках.

При связывании четырех Са2+ (на схеме голубые кружочки) кальмодулин переходит в активную форму, взаимодействующую с многочисленными белками. За счет активации кальмодулина Са2+ оказывают влияние на активность ферментов, ионных насосов и компонентов цитоскелета.

приводит к образованию двух вторичных мессенджеров:
инозитол-1,4,5-трифосфата (ИФ3) и
диацилглицерола (ДАГ).

Гидрофильный

ИФ3 поступает в эндоплазматический ретикулум [ЭР (ЕR)] и индуцирует высвобождение ионов Са2+ из запасающих везикул.

Липофильный ДАГ остается в мембране и активирует протеинкиназу C, которая в присутствии Са2+ фосфорилирует различные белковые субстраты, модулируя их функциональную активность.

и
внутриклеточную часть,

внутриклеточная часть обладает ферментативной активностью, либо тесно связана

с другим ферментом.

активностью;
связанные с тирозинкиназами;
с гуанилатциклазной активностью;
с тирозинфосфатазной активностью.

что включает их активность и они фосфорилируют специфичные белки-эффекторы по

остаткам тирозина. Активированные рецепторы часто фосфорилируют сами себя, что называется аутофосфорилированием.
Например, таким образом действует инсулин и цитокины, относящиеся к факторам роста.

2. Рецепторы с серин-треонин киназной активностью способны осуществлять как аутофосфорилирование, так и фосфорилирование внутриклеточных белков. По этому механизму действуют циокины (TGFβ, морфогенетические белки кости).

с тирозинкиназами, находящимися в цитозоле, т.е. они ассоциированы с тирозинкиназной

активностью.
Так действуют соматотропный гормон, пролактин, цитокины-интерфероны (α, β, γ), колониестимулирующие факторы, интерлейкины, эритропоэтин.

4. Рецепторы с гуанилатциклазной активностью образуют вторичный мессенджер цГМФ из ГТФ.
По этому механизму действуют натрийуретические пептиды.

5. Рецепторы с тирозинфосфатазной активностью – примером служит общий лейкоцитарный антиген CD-45 (англ. Cluster of Differentiation). Он представлен на всех клетках крови, кроме зрелых эритроцитов, и обеспечивает прохождение сигнала от антигена внутрь клетки.

рецепторами на внешней стороне плазматической мембраны (см. следующий слайд).

Связывание цитокинов

с рецептором (1) через ряд промежуточных стадий (2-5) активирует транскрипцию определенных генов (6).

Сами цитокиновые рецепторы не обладают тирозинкиназной активностью (за немногими исключениями).

После связывания с цитокином (1) молекулы рецептора ассоциируют, образуя гомодимеры.

некроза опухоли
Семейство иммуноглобулиновых рецепторов
Семейство
цитокинов
Янус киназа
Сигнальный трансдуктор и Активатор транскрипции
Рецептор, связанный

с фактором некроза опухоли

Интерлейкин-1 рецептор, связанный с киназой

Фибронектин родственный домен

Последовательности богатые цистеином

Домен, родственный к иммуноглобулину

Внутриклеточный домен

Трансмембранный домен

Янус киназа/Сигнальный трансдуктор и Активатор транскрипции

Фосфоинозитид-3 киназа

Митоген активированная протеинкиназа

Ядерный фактор -легкой цепи-энхансер, активирующий В-клетки

белками-переносчиками сигнала [БПС (STP)] или стимулировать димеризацию самих БПС.
Цитокиновые рецепторы

класса I могут агрегировать с тремя типами БПС: белками GP130, βс или γс.
Эти вспомогательные белки сами не способны связывать цитокины, но они осуществляют передачу сигнала на тирозинкиназы.
Например, рецептор ИЛ-6 (IL-6) после связывания с лигандом стимулирует димеризацию белка GP130.
Димер мембранного белка GP130 связывает и активирует цитоплазматическую тирозинкиназу ЯК-семейства (Янус-киназы, имеющие два активных центра).
Янус-киназы фосфорилируют цитокиновые рецепторы, БПС и различные цитоплазматические белки, которые осуществляют дальнейшую передачу сигнала; они также фосфорилируют факторы транскрипции — переносчики сигнала и активаторы транскрипции [ПСАТ (STAT, от англ. signal transducers and activators of transcription)].

узнающий остатки фосфотирозина.
Поэтому они обладают свойством ассоциировать с фосфорилированным

цитокиновым рецептором.
Если затем происходит фосфорилирование молекулы ПСАТ,
фактор переходит в активную форму и образует димер.
После транслокации в ядро димер в качестве фактора транскрипции связывается с промотором инициируемого гена и индуцирует его транскрипцию.

Некоторые цитокиновые рецепторы могут за счет протеолиза утрачивать экстрацеллюлярный лигандсвязывающий домен. Домен поступает в кровь, где конкурирует за связывание с цитокином, что снижает концентрацию цитокина в крови.

факторов транскрипции эукариот, участвуют в передаче сигнала
от большого числа

цитокинов и факторов роста
MAP семейство киназ – это митоген-активируемые протеинкиназы.

многофункциональным действием. Взаимоперекрывание между цитокинами приводят к тому, что в

действии многих из них наблюдается синергизм, а некоторые цитокины являются антагонистами. Часто в организме можно наблюдать весь каскад цитокинов со сложной обратной связью.

Сеть цитокиновых взаимодействий
при воспалении

Внимание! Это демонстрация.
Не для попыток заучивания

клетки.
Например, когда нейротрансмиттер ГАМК активирует свой рецептор, входящий в

состав ионного канала на поверхности нейрона, канал начинает пропускать ионы хлорида, что приводит к изменению мембранного потенциала всей клетки.
В других случаях активация рецептора лишь инициирует цепь событий, передающих регуляторный стимул внутри клетки через более или менее длинную цепь посредников. Такая цепь называется сигнальным путем.

расщепить его, часть белка может затем попасть в клеточное ядро

и выполнять функции регулятора транскрипции.

В результате клетка начинает синтезировать другие белки и изменяет свое поведение.

Более сложный сигнальный путь инициируют факторы роста.

Некоторые из их рецепторов являются киназами и после активации фосфорилируют себя и другие белки, тем самым изменяя способность к межбелковому взаимодействию.

фосфорилирование.

Фосфорилированный рецептор может связывать адапторный белок GRB2, передающий сигнал на

следующий посредник.

Далее это может привести к активации сигнального пути Ras-MAPK.

В нем киназа MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) может далее активировать фактор транскрипции C-myc и изменять функционирование ряда генов, влияющих на клеточный цикл.