Ингибирование ферментативной активности

веществ - ингибиторов.

К ингибиторам следует относить вещества, вызывающие снижение

активности фермента.

Все денатурирующие агенты также вызывают уменьшение скорости любой ферментативной реакции, вследствие неспецифической денатурации белковой молекулы, поэтому денатурирующие агенты к ингибиторам НЕ относят.

установить роль отдельных ферментов в метаболических путях организма.
В основе

действия многих лекарственных препаратов и ядов лежит ингибирование активности ферментов, поэтому знание механизмов этого процесса крайне важно для молекулярной фармакологии и токсикологии.

Ингибиторы способны взаимодействовать с ферментами с разной степенью прочности.
На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование.
По механизму действия ингибиторы подразделяют на конкурентные и неконкурентные.

определённых условиях легко отделяются от фермента.
Характерная черта обратимого ингибирования

– наличие равновесия между ферментом и ингибитором. При этом константа равновесия или константа ингибирования (Кi) служит мерой сродства фермента и ингибитора и выражает эффективность действия ингибитора.
Обратимые ингибиторы бывают конкурентными, неконкурентными и бесконкурентным.

реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим

образованию фермент-субстратного комплекса.

Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор - структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется.

ES → E + P,

E + I ⇔ EI.

Классический пример

конкурентного ингибирования - ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой (рис).
Малоновая кислота - структурный аналог сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Однако отщепление двух атомов водорода от малоновой кислоты невозможно; следовательно, скорость реакции снижается.

- в ходе ферментативной реакции происходит отщепление двух атомов водорода

от сукцината и присоединение их к ко-ферменту FAD. В результате образуется фумарат, который высвобождается из активного центра сукцинатдегидрогеназы; ill - малоновая кислота - структурный аналог сукцината, она также связывается с активным центром сукцинатдегидрогеназы. При этом химическая реакция не идёт.

Кm для данного субстрата (уменьшает сродство субстрата к ферменту). Vmax не

изменяется.
Это означает, что в присутствии конкурентного ингибитора необходима большая концентрация субстрата для достижения 1/2 Vmax.

Увеличение соотношения концентрации субстрата и ингибитора снижает степень ингибирования. При значительно более высоких концентрациях субстрата ингибирование полностью исчезает, потому что активные центры всех молекул фермента будут находиться преимущественно в комплексе с субстратом.

действие по механизму конкурентного ингибирования. Например, четвертичные аммониевые основания ингибируют

ацетилхолинэстеразу, катализирующую реакцию гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту.
При добавлении ингибиторов активность ацетилхолинэстеразы уменьшается, концентрация ацетилхолина (субстрата) увеличивается, что сопровождается усилением проведения нервного импульса. Ингибиторы холинэстеразы используют при лечении мышечных дистрофий. Эффективные антихолинэстеразные препараты - прозерин, эндрофоний и др.

место гидролиза эфирной связи в молекуле ацетилхолина;
Б - присоединение

конкурентного ингибитора - прозерина в активном центре фермента. Указано место гидролиза прозерина, однако реакция идёт намного медленнее, чем с ацетилхолином;
В - присоединение конкурентного ингибитора в активном центре фермента - эндрофония. Эндрофоний связывается в активном центре ацетилхолинэстеразы, препятствуя присоединению ацетилхолина.

в медицинской практике используют вещества, называемые антиметаболитами. Эти соединения, будучи

структурными аналогами природных субстратов, вызывают конкурентное ингибирование ферментов, с одной стороны, и, с другой - могут использоваться этими же ферментами в качестве псевдосубстратов, что приводит к синтезу аномальных продуктов. Аномальные продукты не обладают функциональной активностью; в результате наблюдают снижение скорости определённых метаболических путей.

В качестве лекарственных препаратов используют следующие антиметаболиты: сульфаниламидные препараты (аналоги парааминобензойной кислоты), применяемые для лечения инфекционных заболеваний, аналоги нуклеотидов для лечения онкологических заболеваний

ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра.

Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.

Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс.
Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет

его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор, в свою очередь, так меняет конформацию фермента, что катализ становится невозможным.

и константа Михаэлиса уменьшаются в одинаковое число раз.

с ферментом, что препятствует образованию продукта.
Схема и уравнение Михаэлиса-Ментен в

случае ингибирования субстратом:

молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр

фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению.
При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.

выяснения механизма действия ферментов.

С этой целью применяют вещества, блокирующие

определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента.

фторфосфатов, например диизопропилфторфосфата.

Диизопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним

из многих остатков серина в активном центре фермента.

цистеина белков.

Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они
реагируют

с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.

основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин.

Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами.

концевой NH2-группе одной из субъединиц циклооксигеназы.