БИОТЕХНОЛОГИЯ Гормональных препаратов

них играет очень важную роль в регулировании функций тех или

иных органов

мембран клеток для глюкозы,
2. Активирует ферменты гликолиза (см. след.

рис.)
3. Стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена,
4. Подавляет активность ферментов, расщепляющих гликоген и жиры
5. Усиливает синтез жиров и белков.

— 6-Фосфофруктокиназа 4 — Альдолаза 5 — Триозофосфатизомераза

6 — Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 7 — Фосфоглицераткиназа 8 — Фосфоглицеромутаза 9 — Eнолаза 10 — Пируваткиназа

РНК, выделенной из этих клеток, кодируют именно инсулин.
Инсулин секретируется в

ответ на стимуляторы секреции инсулина (глюкозу, маннозу, аминокислоты – лейцин, аргинин). Человеческая поджелудочная железа содержит до 8 мг инсулина (200 биол. Ед; 1 мг = 28 БЕ).

- 2 полипептидные цепи, соединенные дисульфидными мостиками:
цепь А -

21 аминокислота
цепь Б – 30 аминокислот

Аминокислотный состав цепей видоспецифичен

Структура инсулина расшифрована в 1954 г. англ. биохимиком
Ф. Сенджером

Лангерганса

на полирибосомах, прикрепленных к наружной поверхности мембраны эндоплазматического ретикулюма (ЭР);

3 - сигнальный пептид отщепляется по завершении синтеза полипептидной цепи и образуется проинсулин;
4 - проинсулин транспортируется из ЭР в аппарат Гольджи и расщепляется на инсулин и С-пептид;
5 - Молекулы инсулина, соединяются с ионами цинка и образуют кристаллические гексамерные агрегаты. Кристаллы инсулина включаются в секреторные гранулы и депонируются,
6 – зрелые гранулы постепенно выделяются путем экзоцитоза (6);

Биосинтез инсулина в β-клетках островков Лангерганса

ядро

мРНК

of six insulin molecules assembled in a hexamer, highlighting the

threefold symmetry, the zinc ions holding it together, and the histidine residues involved in zinc binding. Insulin is stored in the body as a hexamer, while the active form is the monomer.

+ 2 Zn2+

После экзоцитоза кристаллы инсулина, попадают в межклеточное пространство и кровоток. Изменение физических свойств среды приводит к отщеплению цинка и распаду кристаллического неактивного инсулина на отдельные молекулы, которые и обладают биологической активностью.

Биологически активные
молекулы инсулина

Синтез ɑ- и β-цепей инсулина в клетках E. Coli с

последующим соединением их в молекулу гормона (Великобритания)

ΙΙΙ. Синтез проинсулина в клетках E. Coli с последующим преобразованием в инсулин (РАН ИБОХ)

Ферментативное замещение 30-й аминокислоты в цепи В (у свиней –

это аланин) на треонин (у человека) и последующая хроматографическая очистка

Метод разработан в 1980г. датской фармкомпанией «Novo»

N-конце гена - кодон ТAС (метионин), а на С-конце -

два стоп-кодона (терминатор).

Ген присоединяют к фрагменту гена β-галактозидазы Е. coli в С-кон-цевой части. Образующийся гибридный ген имеет свой промотор и свой рибо-сом-связывающий участок

Встраивают в плазмиду ВpR322 с помощью ДНК-лигазы
Гибридный ген трансформируют в клетку-хозяина
Выделяют и культивируют транс-формированные клетки
Проинсулин, в составе β-галакто-зидазного гибридного белка выделяют и подвергают химико-ферментативной трансформации в той же последователь-ности, что и in vivo:
отщепляют β-галактозидазный фрагмент,
проводят окислительный сульфитолиз с последующим восстановительным замыканием 3-х дисульфидных связей
Ферментативно (эндопептидаза) вычленяют связывающий центральный пептид C.

антител.
Используется хроматографическая очистка:
Ионообменная,
Гелевая
ВЭЖХ.
Наиболее эффективна аффинная хроматография

зависимости от содержания проинсулина:
обычные, содержат проинсулин более 1%
монопиковые – менее

0,3% (Гельфильтрационная хроматография)
улучшенные монопиковые – менее 0,005%
монокомпонентные – менее 0,001%
Полный контроль производства генноинженерного инсулина включает:
контроль стабильности рекомбинантного штамма и плазмиды,
отсутствие постороннего генетического материала в препарате,
идентичность экспрессируемого гена
и т.д., всего 22 показателя.

вовсе не замысловатый сюжет повести Еремея Парнова «Ларец Марии Медичи»

привлек наше внимание к ней. Дело здесь в ином, во вполне банальной жизненной ситуации, в которой по воле автора оказываются главные герои. Их, как и положено, двое — он и она, Вера Фабиановна и Лев Минеевич. Она — высокая, властная и по сей день замечательно красивая старуха, он — маленький, пухленький старичок с детскими ручонками. И тот и другой не раз и не два задумывались на склоне лет, почему же, собственно, так и не соединились их судьбы?
А виной тому была так, безделица, совсем пустячок — маленький рост Льва Минеевича. Стоит ли дальше рассуждать по этому поводу? Или и так всем все понятно?

Между тем беде Льва Минеевича, появись он на свет лет эдак на 65 попозже, вполне можно было б помочь. По крайней мере, искусственно синтезируемый соматотропин (гормон роста), продуцируемый в организме гипофизом, важнейшей железой эндокринной системы, сегодня — реально существующий препарат. И, как очевидно из вышеприведенной информации, производство его весьма доходное, а сам он — предмет коммерции многих фирм, занимающихся сбытом биотехнологической продукции.

алхимики средневековья не предполагали, какое именно активное начало содержится в

экстракте, приготовленном из железы, что расположена у самого основания черепа. Но зато они знали, как из него сделать экстракт и как с его помощью вырастить чудовищно гигантских крыс.
Экспериментировали с гипофизом и в XIX столетии, а в XX веке гипофизы умерших или погибших по разным причинам людей стали для медиков и фармакологов единственным источником соматотропина, с помощью которого они возвращали нуждающимся в помощи детям, в некотором смысле обделенным природой, высокий рост. А вместе с ним — красоту и уверенность в себе.
Но курс лечения долог и эффективен только при наличии нужных количеств дефицитного гормона. Под словами «нужных количеств» здесь имеются в виду вполне конкретные цифры: полный курс лечения, обеспечивающий мальчику или девочке нормальное развитие, предполагает такое количество соматотропина, которое в состоянии наработать 100—150 человеческих гипофизов. А где их столько взять?

читатель, ведь никто не запрещает специалистам воспользоваться гипофизами животного происхождения,

они ведь тоже продуцируют соматотропин.
В том-то и дело, что человеку нужен только человеческий гормон роста. Препарат животного происхождения (точнее, выделенный из гипофиза крупного рогатого скота) ему не подходит, поскольку гормон роста — видоспецифический.
Правда, как и во всяком правиле, здесь тоже есть исключение. Крыса, например, на соматотропин любого происхождения реагирует как на свой собственный, столь пластична и легко приспособляема ее природа.
Но человек — не крыса; его «любой» гормон не устраивает. Значит, уповать приходится только на чужую беду. Вот почему до недавнего времени все производство натурального соматотропина основывалось на экстрактах, приготовленных из трупных гипофизов.

ученый «пришивал» к поверхности твердого носителя собираемые в определенной последовательности

аминокислоты полипептидов) пока не идет ни в какое сравнение с естественным, природным синтезатором — живой клеткой, в котором белки производятся по аналогичной схеме, а вот ошибки исключаются вовсе. Ведь в клетке без устали трудится, не зная ни смен, ни вахт, собственное ОТК — самоконтроль.
Вот почему по точности и эффективности с клеточным производством не может сравниться ничто на свете — в ней молекула управляет молекулой.

и для лечения ожогов, переломов, язв.
1963 – получали из

трупного материала, всего 4-6 мг соматотропина из 1 трупа. Этого количества катастрофически не хватало.
Кроме того были частыми явления заражения гипофизарного материала нейротоксическим вирусом с очень длительным инкубационным периодом. Этот вирус нередко приводил к летальному исходу реципиентов гормона трупного происхождения. В 1985 г. ВОЗ запретила применение СТГ, выделяемого из трупных человеческих гипофизов.
В 1980 г. фирмой «Genentech» получен рекомбинантный СТГ – соматрем. Отличается более высокой активностью от искусственно получаемого гипофизарного ввиду более высокой степени очистки.

следующие проблемы.
Регуляторные сигналы эукариот сильно отличаются от регуляторных сигналов бактерий

и не узнаются бактериальными РНК-полимеразами и рибосомами. При клонировании в бактериях ДНК эукариотической клетки экспрессия не происходит, поскольку в бактериальной клетке отсутствует система "сплайсинга".
Поэтому для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии - промотору и рибосом-связывающему участку.
Присоединение ведется таким образом, что кодирующая часть эукариотического гена присоединяется к кодирующей части бактериального гена так, чтобы сохранялась "рамка" считывания. В этом случае образуются гибридные белки, содержащие в N-концевой части бактериальный белок или его часть, а в С-концевой части - эукариотический белок. Примером использования такого способа экспрессии является получение гонадотропного гормона соматостатина в клетках Е. Coli

и Г. Бойером.
Аминокислотная последовательность этого гормона была известна биотехнологам,

и исходя из нее, согласно генетическому коду, была выведена структура соответствующего искусственного гена.
После этого был осуществлен его синтез: ген содержал на N-конце кодон АТС, кодирующий метионин, и липкий конец, соответствующий расщеплению рестриктазой EcoRI - AATT, а на С-конце - два стоп-кодона.
Этот фрагмент ДНК был присоединен к фрагменту гена бета-галактозидазы Е. coli, содержащему в С-концевой части участок расщепления EcoRI, и вместе со своим промотором и оператором был встроен в плазмиду pBR322. В результате такого соединения получен гибридный ген, в котором С-концевая часть гена бета-галактозидазы заменена "геном" соматостатина. Между геном бета-галактозидазы и собственно геном соматостатина находится кодон метионина.

химерном белке соматостатин отделен от галактозидазной части остатком метионина.
Поскольку

соматостатин (ЛВ) не содержит метиониновых остатков, то химерный белок расщепляют бромцианом и отделяют соматостатин в виде целого пептида

почках в ответ на тканевую гипоксию. Он воздействует на специфические

рецепторы костного мозга и стимулирует пролиферацию, митоз и созревание эритроцитов. Секреция эритропоэтина почками усиливается при кровопотере, различных анемических состояниях (железо-, фолат- и B12-дефицитных анемиях, анемиях, связанных с поражениями костного мозга и др.), при гипоксических состояниях.
Как ЛС показан больным с почечной недостаточностью и выраженной анемией. Повышает уровень гемоглобина, полезен при СПИДе и раке.
Получение значимых количеств эритропоэтина человека из почек невозможно из-за низкого его содержания.
Рекомбинантный человеческий эритропоэтин получают в культуре клеток млекопитающих. Очистка производится ионно-обменной и имунно-афинной хроматографией, производитель - фирма Amgen (США).
В РФ НПО «Микроген» выпускает высокоочищенный рекомбинантный эритропоэтин человека с сывороточным альбумином в виде раствора на изотоническом цитратном буфере под названием «Эритростим».