Экспрессия генов: транскрипция, трансляция и судьба белков

(РНК и ДНК), которые своей совокупностью образуют в пространстве высокоупорядоченные

структуры - хромосомы эукариот.

Условно весь хроматин подразделяется на две функциональные категории:
неактивная - гетерохроматин - содержит в себе в данный момент несчитываемую генетическую информацию;
активная - эухроматин - именно с него производится считывание генетической информации.

правило, препятствуют связанные с хроматином белковые факторы, узнающие определённые последовательности ДНК. К

числу таких белков относятся транскрипционные факторы, ДНК- или РНК-полимеразы.
Открытый хроматин часто совпадает с цис-регуляторными последовательностями, а именно: промоторами, энхансерами, инсуляторами, сайленсерами, участками начала репликации ДНК.
В зависимости от типа белковых факторов, связывание которых с ДНК препятствует посадке нуклеосом, гиперчувствительные к ДНКазе I участки хроматина могут быть тканеспецифичными или конститутивными, то есть присутствующими в клетках, дифференцированных по разным путям.

включает 3 стадии:
Инициация – присоединение полимеразы к промотору, активация

процесса.
Элонгация – наращивание нуклеотидной цепи в направлении от 3´к 5´ концу с замыканием фосфодиэфирных связей между азотистыми основаниями, которые подбираются комплементарно мономерам ДНК.
Терминация – завершение процесса синтеза.

У прокариот все виды РНК транскрибируются одной РНК-полимеразой, состоящей из пяти протомеров (β, β′, ω и двух субъединиц α), которые в совокупности образуют кор-фермент, способный наращивать цепь рибонуклеотидов. Есть еще дополнительная единица σ, без которой невозможно присоединение полимеразы к промотору. Комплекс из кора и сигма-фактора называется холоферментом.

участка ДНК (A -U, G-C,C-G, T-A).
Антипараллельность - синтезируемая цепь РНК

направлена антипараллельно транскрибируемому участку.
Ассиметричность - транскрибируется лишь одна из цепей ДНК - матричная цепь, смысловая цепь не транскрибируется.
Униполярность - синтез нуклеотидной цепи всегда направлен 5’ -> 3’
Отсутствие потребности в затравке - транскрипция начинается с нуклеотидтрифосфата и не требует затравочных олигонуклеотидов.

II и III, представляющие собой мультибелковые комплексы и ответственные за

транскрипцию с соответствующих промоторов:
Класс I (гены, кодирующие рибосомальные РНК)
Класс II (гены, кодирующие матричные РНК и некоторые малые ядерные РНК)
Класс III (гены, кодирующие транспортные РНК и оставшиеся малые ядерные РНК).

У прокариот один и тот же фермент катализирует синтез трёх типов РНК: мРНК, рРНК и тРНК.

время синтеза только часть молекулы РНК спарена с матрицей (с

молекулой ДНК)
РНК-полимеразам не требуется затравка для начала синтеза РНК
у РНК-полимеразы нет корректирующей активности, то есть, РНК-полимераза не может сама исправлять ошибки при синтезе РНК

- отвечают за распознавание промоторов и создание преинициаторного комплекса. Необходимы

для начала транскрипции. Эта группа насчитывает несколько десятков белков, которые всегда присутствуют в клетке и не влияют на дифференциальную экспрессию генов.
Регуляторные - влияют на транскрипцию за счет взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК, ген-специфичны. Связываясь с участками конкретных генов, они контролируют секрецию определенных белков.

образованием комплекса инициации и активацией транскрипции.

Специфические факторы могут регулировать

транскрипцию на двух этапах:
сборка комплекса инициации (перестройка хроматина, а также привлечение, ориентация и модификация медиатора, полимеразы и базальных факторов на промоторе, что приводит к активации транскрипции);
переход к продуктивной элонгации (осуществляется за счет взаимодействия фактора с белком P-Tef-b, который помогает РНК-полимеразе преодолеть ассоциированную с промотором паузу.)

Факторы транскрипции. Принцип действия

свою работу за счет трех функциональных доменов:
ДНК-связывающего (DBD) –

нужен для распознавания и взаимодействия с регуляторным участком гена.
Транс-активирующего (TAD) – позволяет взаимодействовать с другими регуляторными белками, включая транскрипционные факторы.
Сигнал-распознающего (SSD) – необходим для восприятия и передачи регуляторных сигналов.
Димеризационный домен

кислые)
Глутамин-богатые (Sp1, ~25% Ак – глутамин)
Пролин-богатые (CTF, из

84 Ак – 19 пролин)

ДНК-связывающие домены
Взаимодействуют в основном с большой бороздкой ДНК
Образуют водородные связи с азотистыми основаниями
Узнают определённые нуклеотидные последовательности

к ДНК за счет фосфорилирования, присоединения лиганда или взаимодействия с

другими регуляторными белками (в том числе ТФ)
Транслокация – транспортировка фактора из цитоплазмы в ядро
Доступность сайта связывания – зависит от степени конденсации хроматина (в состоянии гетерохроматина ДНК недоступна для ТФ)
Комплекс механизмов, характерных и для других белков (регуляция всех процессов от транскрипции до пострансляционной модификации и внутриклеточной локализации).
Некоторые ТФ способны регулировать свой синтез по типу классической обратной связи, когда ингибитором реакции становится ее собственный продукт. В таком случае определенная концентрация фактора останавливает транскрипцию кодирующего его гена.

РНК-полимеразы на промоторе;
Расплетание цепей ДНК в области начала транскрипции;
Освобождение полимеразы

от промотора в момент перехода к элонгации. Определенные субъединицы базальных факторов транскрипции связываются с регуляторными элементами промотора.








Самым важным является ТАТА-бокс (характерен не для всех генов), расположенный на расстоянии "-35" нуклеотидов от точки инициации. Другие сайты связывания включают последовательности INR, BRE и DPE. Некоторые ТФ напрямую с ДНК не контактируют.

содержащего бокс TATA, в открытом хроматине инициируется, когда субъединица TBP

катализирует связывание TFIID с ТATA боксом.
TFIIB связывается вниз по течению от TATA-TBP комплекса. Он связывается с промотором в малой канавке после блока TATA и контактирует с основной канавкой перед блоком TATA в области, называемой BRE. Считается, что этот шаг является основным определяющим фактором в установлении промоторной полярности, и определении матричной цепи ДНК.
TFIIB отвечает за направленность связывания полимеразы. TFIIB также играет главную роль в рекрутировании РНК pol II в комплекс ДНК TFIID / TFIIA/промотор, помогая в превращении из закрытого в открытый комплекс и выборе начального сайта транскрипции (TSS).  
N-концевое цинковое кольцо TFIIB связывается с ферментом рядом с местом выхода РНК; возможно, это предотвращает выход РНК из транскрипции. Удлиненный «палец» TFIIB взаимодействует с активным центром полимеразы. С-терминальный домен взаимодействует с РНК-полимеразой и с TFIID для стабилизации старта плавления промотора.
Фактор TFIIF cостоит из двух типов субъединиц, и необходим для сборки PIC (преинициаторного комплекса). Большая субъединица (RAP74) обладает АТФ-зависимой ДНК-геликазной активностью. Меньшая субъединица (RAP38) связывается с РНК-полимеразой II. TFIIF способствует доставке РНК-полимеразы II в транскрипционный комплекс и вместе с TFIIB участвует в поиске сайта запуска транскрипции.

процессы как отдельных клеток, так и целого организма начиная от

эмбриогенеза заканчивая тонкой фенотипической адаптацией к изменяющимся условиям среды.
развитие (эмбрио- и онтогенез);
клеточный цикл;
ответ на внешние сигналы.

Самостоятельно найдите пример для специфических транскрипционных факторов

= ативация транскрипции
Сайленсер + репрессор = подавление транскрипции
Не зависят

от ориентации
Могут находиться на значительном расстоянии от промотора

исходящие от окружения. Эта функция инсуляторов включает две активности:

Блокируют взаимодействие

между энхансером и промотором, если находится между ними. При этом инсулятор выполняет только разделительную функцию и не влияет на активность энхансера и промотора

Роль барьера для распространяющегося конденсированного хроматина.

через необычный для РНК 5’, 5’ – трифосфатный мостик, а

так же метилирование остатков рибозы двух первых нуклеотидов. Процесс кэпирования происходит во время синтеза молекулы пре-мРНК. Кэпирование защищает 5’-конец первичного транскрипта от действия рибонуклеаз, специфически разрезающих фосфодиэфирные связи в напрявлении 5’-3’

Функции кэпа и связанных с ним белков:
Участие в сплайсинге
Участие в процессинге 3’-конца мРНК
Экспорт мРНК из ядра
Защита 5’-конца транскрипта от экзонуклеаз
Участие в инициации трансляции

200 остатков аденина.
Полиаденилирование осуществляется только при наличии сигнальной последовательности

5’-AAUAAA-3’ на 3’-конце транскрипта, за которой следует 5’-CA-3’. Вторая последовательность является сайтом разрезания.

Функции полиаденилирования:
Полиаденилирование защищает мРНК от ферментативного разрушения в цитоплазме.
Влияет на время жизни мРНК в цитоплазме.
Способствует терминации транскрипции.
Участвует в экспорте мРНК из ядра и трансляции.

а экзоны сшиваются. Сплайсинг катализируется крупным нуклеопротеидным комплексом – сплайсосомой,

состоящей из белков и малых ядерных РНК.
Многие пре-мРНК могут быть подвергнуты сплайсингу разными путями, при этом образуются разные зрелые мРНК, кодирующие разные последовательности аминокислот (альтернативный сплайсинг).

область (5'-UTR), с которой связываются белки, играющие важнейшую роль в

регуляции инициации трансляции. К их числу относятся собственно белковые факторы инициации (elF), а также белки-репрессоры трансляции. В инициации трансляции принимают участие также З'-нетранслируемая область (3'-UTR) и поли(А)-хвосты мРНК. В З'-UTR имеются и особые последовательности: сигналы полиаденилирования и сигнал внутриклеточной локализации.
С З'-UTR способны связываться маскирующие белки (они делают мРНК недоступной для трансляции рибосомами) и дестабилизирующие белки, контролирующие доступность мРНК для атаки нуклеаз и таким образом определяющие время жизни мРНК в клетке.
В кодирующем участке (транслируемая область) с мРНК связываются факторы элонгации (eEF), АРСазы (аминоацил-тРНК-синтетазы), рибосомы, а также определенные ферменты, необходимые для процесса трансляции. В кодирующей области мРНК расположены также сигналы перекодирования (репрограммирования) трансляции, благодаря которым с одной и той же мРНК могут транслироваться разные белки.

3'-UTR районах встречаются ARE элементы (AU-rich element), с высокой частотой

аденина (A) и уридина (U)
Связывание ряда белков из семейства RBP (RNA-binding proteins) с ARE элементом индуцирует деградацию мРНК.
Гены раннего ответа, которые отвечают на широкий спектр внешних сигналов, включая онкогены и цитокины, имеют относительно короткое время жизни из-за ARE элементов в их мРНК
Другой тип RBP белков, включая HuR, связываясь с ARE регулирует стабильность мРНК за счет препятствия доступа к ней эндонуклеаз.

с последующим расщеплением в направлении 3 '-> 5',
удаление 5'-Кэпа с

последующим расщеплением в направлении 5 '-> 3'
Эндонуклеазное расщепление с последующей деградацией при участии экзонуклеаз по 5 'и 3' концам.

быть выведены из ядра в цитоплазму.
Зрелые мРНК распознаются по наличию модификаций и

покидают ядро через ядерные поры, в цитоплазме мРНК образует нуклеопротеидные комплексы — информосомы, в составе которых транспортируется к рибосомам. Многие мРНК содержат сигналы, которые определяют их локализацию.
Экспорт мРНК эукариот осуществляется при участии комплекса транспортных факторов TAP—p15. Однако этот комплекс связывает мРНК не напрямую, а через адаптерный белок ALY/REF, который является одной из субъединиц белкового комплекса TREX. В свою очередь, TREX привлекается в комплекс с мРНК за счёт прямого взаимодействия ALY/REF с CBC80 субъединицей кэп-связывающего комплекса. Такой механизм обеспечивает присоединение транспортного комплекса близко к 5'-концу мРНК и соответствующую направленность её транспорта, 5'-концом в сторону цитоплазмы.

с образованием «шпилек» на участках с равным количеством остатков аденина

и урацила или гуанина и цитозина, вторичная структура с двуцепочными участками составляет до 25% всей мРНК. 

Вторичные структуры в мРНК служат для регуляции трансляции. Например, вставка в белки необычных аминокислот, селенометионина и пирролизина, зависит от стебля-петли, расположенной в 3'-нетранслируемой области. Псевдоузлы служат для программированного изменения рамки считывания генов. Также вторичная структура служит для замедления деградации определенных мРНК.

стебель-петля

псевдоузел

с аминоацильным остатком, превращаясь в аминоацил-тРНК;
Адапторная функция – способность узнавать триплет

генетического кода, соответствующий транспортируемой аминокислоте, и обеспечивать поступление аминокислоты на «законное» место в растущей цепи белка.
В антикодоновой петле РНК имеется антикодон, комплементарный кодовому триплету определенной аминокислоты.
Акцепторный участок на 3'-конце способен с помощью фермента аминоацил-тРНК-синтетазы присоединять именно эту аминокислоту (с затратой АТФ) к участку ССА.

на первом этапе биосинтеза белка – двад­цать различных аминокислот присоеди­няются

эфирной связью к соответствую­щим тРНК под действием двадцати различных специфичных активирую­щих ферментов, называемыми аминоацил-тРНК-синтетазами.
Аминоацилирование состоит из двух стадий:
Образование аминоациладенилата в результате взаимо­действия АТР и аминокислоты.
Перенос аминоацильного оста­тка с аминоациладенилата, связанного с ферментом, на соответ­ствующую специфическую тРНК 

малая субъединица рибосомы в Р-сайт которой заходит тРНК с метионином

(инициаторный комплекс).
У эукариот старт-сайтом трансляции обычно, но не всегда, является первый AUG кодон, в зависимости от нуклеотидного контекста вокруг AUG.
У эукариот существуют два основных механизма нахождения рибосомой стартового AUG:
Кэп-зависимый (сканирующий). При сканирующем механизме малая субъединица рибосомы садится на 5'-конец мРНК в области кэпа и двигается вдоль молекулы мРНК, «сканирует» кодоны в поисках инициаторного AUG.
Кэп-независимый (внутренняя инициация). Механизм внутренней инициации осуществляется за счет элементов IRES (англ. Internal Ribosomal Entry Site) — участок мРНК, обладающий выраженной вторичной структурой, позволяющей ему направлять рибосомы на стартовый AUG. 10–15% всех мРНК способны к КЭП-независимой трансляции.

группой метионина и аминогрупой второй аминокислоты

способный «читать» все три терминирующих кодона
На эффективность терминации трансляции у

эукариот влияет последовательности нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов и структура C-концевой части строящейся полипептидной цепи.

рибосомными белками, которые транспортируются в ядро после синтеза в цитоплазме.

Молекулы рРНК определяют структуру, физические и химические свойства, функции рибосом, а также расположение рибосомных белков в субчастицах рибосом.
Обычно одна молекула мРНК читается сразу несколькими рибосомами, двигающимися вдоль мРНК друг за другом и, таким образом, независимо синтезирующими идентичные молекулы белка, но с соответствующим отставанием. Такой динамический комплекс одной мРНК с несколькими рибосомами называется полирибосомой.
Молекула тРНК крепится к А- и Р-сайтам только если её антикодон образует пары оснований с комплементарным кодоном молекулы мРНК. А- и Р-сайты расположены близко друг к другу чтобы две их тРНК молекулы формировали пары нуклеотидов с примыкающим кодоном молекулы мРНК.
Рибосомы разных клеток различаются по размерам, которые опре­деляются по скорости осаждения при центрифу­гировании. Скорость осаждения измеряется в еди­ницах Сведберга (S). Сведберг – это отношение скорости седиментации к центробежному ускорению, 1S = 10-13 секунд. Коэффициенты седимента­ции разных рибосом варьируют от 5S до 80S.
У прокариот рибосомы имеют коэффициент 70S, а рибосомы цитоплазмы эукариот — 80S.

А-сайт (aminoacyl-tRNA — аминоацил-тРНК)
Р-сайт (peptidyl-tRNA — пептидил-тРНК)
Е-сайт (exit — выход)
мРНК-связывающий участок

трансляции начинается с рекрутирования комплексного эукариотического инициаторного фактора (eIF)4F (eIF4E,

eIF4A и eIF4G) связывающегося с кэпом 5 ‘- конца. 
Впоследствии, рибосомная субъединица 40S, несущая eIF3 и тройной инициаторный комплекс тРНК-eIF2-GTP, рекрутируется на 5'-конец мРНК посредством взаимодействия eIF3 с eIF4G.
 Затем субъединицы 40S сканируют мРНК в направлении от 5 'до 3', пока не встретится соответствующий стартовый кодон. На этом этапе антикодон в инициаторе тРНК (тРНК-Met), расположенный в рибосомном Р-сайте, участвует в спаривании оснований со стартовым кодоном в мРНК. 
Кроме того, было показано, что полиаденозин-связывающий белок (PABP) взаимодействует с eIF4G

Полиовирус:
Давно известно, что заражение культивируемых клеток полиовирусом, членом Picornaviridae, приводит к ингибированию трансляции генов хозяина. 
В частности, кодируемая вирусом протеаза 2А расщепляет eIF4G-компонент eIF4F в специфическом сайте белка. NH 2-терминальный продукт расщепления содержит сайт связывания для eIF4E, PABP, а COOH-терминальный продукт содержит сайты связывания для eIF3 и eIF4A. 

нативную конформацию, присоединить какие-либо молекулы, необходимые для его активности, модифицироваться

под действием протеинкиназ и других энзимов и правильно соединиться с другими частями белка, с которыми он функционирует.
Когда протеин сворачивается в компактную структуру, гидрофобные звенья обращаются внутрь глобулы. Формируется большая часть нековалентных взаимодействий между различными участками молекул. Итогом всех этих энергетически выгодных взаимодействий является конформация с самой низкой энергией.
Для некоторых белков сворачивание начинается с N-конца сразу после выхода полипептида из рибосомы. В этом случае, как только протеин покидает рибосому, через несколько секунд он формирует компактное строение, содержащее окончательную вторичную структуру (спирали и β-листы).
Большинство белков не сворачиваются во время синтеза. Вместо этого они "встречаются" у рибосомы с отдельным классом белков, называемых шаперонами. Связывание с шаперонами обеспечивает правильное сворачивание белка в нативную конформацию.
Известно более 100 вариантов посттрансляционных модификаций белков:
Фолдинг, сплайсинг (отщепление сигнальной последовательности), убиквитинилирование, метилирование, глутатионирование, фосфорилирование, гидроксилирование, гликозилирование и тд.