Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА

методы микробиологии
План
1.Место микроорганизмов в живой природе

2.Этапы развития наук о живом микромире
3.Предмет, задачи и методы изучения

Микробиология (micros- малый, bios- жизнь, logos- учение)= «учение о малых формах жизни» - микроорганизмах
По наличию и строению клеток живую природу можно разделить на 3 группы: прокариоты, эукариоты, бесклеточные формы.
По уровню организации геномов, белок-синтезирующих систем и клеточной стенки выделяют четыре царства жизни: архебактерии, эубактерии, эукариоты, вирусы и плазмиды.
Микроорганизмы – представители всех царств жизни, их основные группы – вирусы, бактерии, простейшие, грибы.

“contagium vivum”
2.морфологический Антони Левенгук 1675г. – простейшие, 1683г.-бактерии
3.физиологический (с 1875г.)

Луи Пастер, Р. Кох
Л.Пастер – микробиологические основы брожения и гниения, промышленная микробиология, анаэробы, асептика и стерилизация, аттенуация и получение вакцин
Р.Кох – выделение чистых культур на плотных средах, окраска анилиновыми красителями, иммерсионная микроскопия, открытие возбудителей туберкулеза, холеры и сибирской язвы, постулаты Хенле-Коха
4.иммунологический И.Мечников, П.Эрлих
1892г. – Д.И.Ивановский - вирусология 1929г. А.Флеминг – пенициллин
5.молекулярно-генетический (со 2 половины 20 века).

не у здоровых или больных другими заболеваниями.
2.Должна быть получена чистая

культура микроба (монокультура).
3. Микроб должен вызывать аналогичное заболевание при заражении животных (экспериментальное воспроизведение).

физиологию, экологию, биологические и генетические св-ва, взаимоотношения с др. формами

жизни), разрабатывает методы их культивирования и идентификации, специфические методы их диагностики, лечения и профилактики.
Иммунология изучает механизмы самозащиты организма от всего генетически чужеродного, поддержания структурной и функциональной целостности организма, а также биологической (антигенной) индивидуальности и видовых различий.

методов диагностики, специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний.
3.Микробиологический контроль окружающей

среды, продуктов питания, соблюдение режимов стерилизации и надзор за источниками инфекции в медицинских учреждениях.
4.Контроль за чувствительностью микроорганизмов к антибиотикам и другим препаратам, состоянием микробиоценозов поверхностей и полостей тела человека.

люминесцентная) и электронная
2.микробиологические (бактериологические, вирусологические, микологические)
3.биологические (метод биопроб)
4. иммунологические и

аллергологические
5.молекулярно-генетические (ПЦР, рестрикционный анализ, секвенс)

морфология бактерий
План
1.Систематика и три ее составляющие (классификация, идентификация, номенклатура)
2.Таксономия и

основные таксоны
3.Фено- и генотипические основы классификации и идентификации
4.Морфология бактерий и строение прокариотической клетки
5.Морфология эукариотических микроорганизмов (грибов, простейших)
Таксономия – наука о методах и принципах распределения (классификации) организмов в соответствии с их иерархией. Классификационные единицы – таксоны.
Основные таксоны: штамм, вариант, вид, род, семейство, порядок, класс, царство

величина, взаиморасположение, структура
2.Тинкториальные окраска по Граму: грам+ и грам-

микроорганизмы
3.Культуральные - характер роста на питательных средах
4.Биохимические – расщепление субстратов, метаболиты, ферменты
5.Физиологические – особенности метаболизма, типы дыхания, подвижность
6.Антигенные - иммуногенность, антигенная структура
7.Дополнительные - антибиотико- и фаго-чувствительность, хим. состав.
Генотипические характеристики
1.Г+Ц%. 2.Степень гомологии ДНК. 3.Рибо- и плазмидотипирование. 4.Рестрикционный анализ. 5.Секвенирование. 6.Филогенетический анализ.

выделенного микроорганизма.
Номенклатура – название микрорганизмов в соответствии с международ.правилами.
Бинарная

номенклатура род/вид: Rickettsia sibirica
Штамм - образец (изолят) данного вида с изученными свойствами  в варианты (серовары, фаговары, биовары, хемовары)  группы (серогруппы)  виды
Колония – видимая изолированная структура при размножении бактерий на плотных питательных средах. Чистая культура – совокупность микроорганизмов одного вида, выросших на питательной среде.
Клон – потомство одной родительской клетки.
Вид - совокупность микроорганизмов, имеющих общее эволюционное происхождение, близкий генотип (степень генетической гомологии более 60%), максимально близкие фенотипические характеристики.

развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.
3.Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.
4.Неспособность к эндоцитозу

(захвату твердых частиц пищи).
5.Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.
6. Меньшие размеры (измеряют в микрометрах – мкм). 1 мм=1000мкм.

стафилококки, тетракокки, сарцины).

2.Палочковидные – бактерии, бациллы, клостридии.
3.Извитые – вибрионы и кампилобактерии, спириллы, спирохеты (трепонемы, боррелии, лептоспиры)
4.Нитевидные (актиномицеты, микобактерии, коринебактерии).

4 – стафилококки; 5 – сарцины; 6 – палочковидные

бактерии; 7 – спириллы; 8 – вибрионы (Шлегель Г., 1987).

аэробные спорообразующие прокариоты, чаще с закругленными концами. Диаметр спор не

превышает поперечника вегетативной клетки (эндоспора).
3.Клостридии – анаэробные спорообразующие прокариоты, диаметр споры больше поперечника клетки (веретено, барабанная палочка, теннисная ракетка).

3-6 - клостридии. 3.Спора расположена субтерминально (форме булавы). 4. Спора

расположена в центре (форма веретена - клостридиальная форма). 5. Спора расположена терминально (форма барабанной палочки). 6. Спора расположена латерально; веретенообразную форма (Шлегель Г., 1987).

крылья чайки, S- форма).
Спириллы – имеют 2-3 завитка.


Спирохеты –

имеют различное число завитков, специфический для каждой группы характер движения и строение (особенно концевых участков). Наибольшее значение имеют рода лептоспир, трепонем и боррелий.

фибрилл (АФ), каждая на одном конце прикреплена к протоплазматическому цилиндру

(ПП – прикрепительная пора). Аксостиль и протоплазматический цилиндр окружены наружной оболочкой (НО). КСт – клеточная стенка; ПМ – плазматическая мембрана; ЦП – цитоплазма (Голт С., 1978). Б и В. Электронные микрофотографии поперечного среза (Б, 110 000 х) и всей клетки (В, 7 000 х) спирохеты с несколькими осевыми фибриллами

стенка Необязательные элементы: капсула, споры, поверхностные волосовидные придатки - жгутики, F-пили,

фимбрии

Схематическое изображение прокариотической (бактериальной) клетки : 8 – ядро (нуклеоид); 9 – рибосомы; 10 – цитоплазма; 12 – жгутики; 13 – капсула; 14 - клеточная стенка; 15 - цитоплазматическая мембрана; 16 – мезосома; (Шлегель Г., 1987).

образование, представленное хромосомой кольцевидной формы), не отделен от цитоплазмы ядерной

мембраной.
Рибосомы и др.эл-ты белоксинтезирующей системы.
Мезосомы (инвагинаты цитоплазматической мембраны).
Метаболические включения (волютин, гликоген, гранулеза).
Плазмиды (внехромосомные ДНК-структуры).
Споры (при спорообразовании).

(Блинов Н.П., 1989). Рибосомы служат местом синтеза белка

формирования клеточной перегородки (септальные мезосомы – участвуют в построении поперечной

перегородки при делении) и мезосомы, сформированные в результате инвагинации периферических участков ЦПМ (латеральные мезосомы). Мезосомы содержат ферментные системы и играют роль в энергетическом обмене. Они являются местом формирования клеточной стенки бактерий и прикрепления нуклеоида в процессе репликации ДНК, участвуют в образовании спор.

Типы строения истинных мезосом: а - ламеллярный; б - г - тубулярные типы (Бирюзова, Поглазова, 1977).

друг к другу и покрытых двумя слоями молекул глобулярного белка

(А.Поликар, 1975).

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму, имеет 3х-слойное строение и выполняет ряд функций: барьерную (осмотическое давление), энергетическую (ферментные
системы, перенос электронов),
транспортную (перенос веществ
в клетку и из клетки).

микоплазм и других молликутов), теряется при образовании L-форм.
Обеспечивает механическую защиту

и постоянство формы бактерий. Основное вещество – пептидогликан.
У грам+ бактерий клеточная стенка толстая, несложно устроенная, в составе преобладают пептидогликан и тейхоевые кислоты.
У грам- бактерий клеточная стенка тоньше, трехслойная за счет наличия наружной мембраны, содержит липополисахариды (ЛПС), фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту.

прокариот: 1 – цитоплазматическая мембрана; 2 – пептидогликан; 3 –

периплазматическое пространство; 4 – наружная мембрана; 5 – ДНК (Гусев В.М., 1985).

зависит важный для систематики признак – окраска по Граму.
Стенка грамположительных

бактерий после окраски по Граму сохраняет комплекс йода с генциановым фиолетовым за счет толстых слоев пептидогликана (окрашены в сине-фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки спиртом и окрашены в розовый цвет за счет докрашивания фуксином.

утрата клеточной стенки делает бактерии нечувствительными к антителам, антибиотикам и

химиопрепаратам, действующим на клеточную стенку. Утрата вирулентности и ряда антигенов клеточной стенки дает возможность длительно персистировать в организме.
Спорообразование – генетически закрепленная способность образовывать эндоспоры – клетки с низкой метаболической активностью и высокой резистентностью. Основные фазы цикла – споруляция (в неблагоприятных условиях) и прорастание (в благоприятных).
Некультивируемые формы характерны для неспоровых грам- бактерий, не высеваются на питательных средах (не образуют колоний), выявляют в ПЦР, соответствуют фазе резервации возбудителя, сохраняют патогенные микробы во внешней среде (холерный вибрион).

Г. Окружение протопласта споры протопластом материнской клетки. Д. Образование кортекса

и оболочек споры. Е. Схема строения зрелой споры. 1 - экзоспориум; 2 - наружная оболочка споры; 3 - внутренняя оболочка споры; 4 - кортекс; 5 - клеточная стенка зародыша; 6 - цитоплазматическая мембрана; 7 - цитоплазма с ядерным веществом (Шлегель Г., 1987).

Капсула (слизистый слой, чаще состоит из полисахаридов и выявляют по

Бурри-Гинсу) защищает от высыхания, фагоцитоза, у сапрофитов – во внешней среде, у патогенов – в организме хозяина.
Фимбрии (реснички) – короткие нити, аппарат адгезии к субстратам (слизистым).
F-пили – фактор фертильности – аппарат конъюгации.
Жгутики – аппарат движения (хемотаксис, аэротаксис, фототаксис) – нитевидные, спирально изогнутые нитевидные структуры. Состоят из сократительного белка флагеллина. По количеству и расположению жгутиков выделяют бактерии – монотрихи, лофотрихи (пучок), амфитрихи (по полюсам), перитрихи (по всему периметру).

ядре эукариотической клетки
Фазовоконтрастная микроскопия внутриклеточных риккетсий
R. typhi – возбудитель эндемического

крысиного (блошиного) сыпного тифа, размножается в цитоплазме. Окраска карболфуксином и синькой (по П.Ф. Здродовскому)
Препарат риккетсий (РИФ) и Электрограмма ультратонкого среза

– ретикулярные тельца (C.A. Mims et al. Medical Microbiology. Mosby,

1993)

мицелий (нитевидные формы), размножаются бесполым путем.
Мицелий подразделяют на субстратный и

воздушный, у низших актиномицетов фрагментируется на типичные одноклеточные бактерии.
Род Mycobacterium – особый состав клеточных стенок (воск, липиды кислотоустойчивость), палочковидные и нитевидные формы.
Рода Actinomyces(анаэробы) и Nocardia (аэробы) – мицелий с тенденцией фрагментации на отдельные клетки.
Высшие актиномицеты (Streptomyces, Micromonospora) – мицелий с наличием наружных неполовых спор (конидий).
Актиномикоз (инфицирование ран, образование абсцессов) с формированием друз – плотных «зерен» мицелия в гное.

данного рода; б – разрез через заросшую бактериями, поверхность агара.

Показаны типичные формы роста субстратного мицелия (СМ) и воздушного мицелия (ВМ), спорофоры (Спф) и спорангии (Спа), а также лишенные жгутиков и обладающие жгутиками споры (спо) (Шлегель Г., 1972).

– переплетение гифов – нитевидных клеточных структур, у высших грибов

с перегородками (септами). Несовершенные грибы размножаются вегетативным путем (спорами – конидиями), совершенные – половым.
Эндоспоры – в специализированных вместилищах (спорангиях), внутри клеток (оидии).Вегетативные экзоспоры – бластоспоры, хламидоспоры, артроспоры, конидиоспоры.
Эндоспоры совершенных грибов - в спорангиях, сферулах. Половые споры у зигомицет (Mucor)– зигоспоры, у аскомицет (Aspergillus, Candida) - аскоспоры (в сумках – асках), у базидиомицет – базидиоспоры на поверхности клетки – базидиума на верхушке четырех стеригм.
У грибов споры – способ размножения, у бактерий – способ выживания в неблагоприятных условиях.

и терминальные (концевые) хламидиоспоры; в – артроспоры; г – конидии

аспергилла; д - конидии пеницилла; е – конидии споротрихума; ж – алейрии; з – спорангии с эндоспорами у мукора; и – сферулы кокцидоидного гриба (Кашкин Н.П., 1979)

базидиоспоры (Кашкин Н.П., 1979)

4.инфузории Простейшие, обитающие в тонкой и толстой кишках: А – лямблия; Б

– дизентерийная амеба; В – кишечная амеба; Г – кишечная трихомонада; Д - балантидий кишечный: а – трофозоиты, б – цисты (Ярыгин В.Н., 1997)