Профессор Хрусталева Л.И. Технология рекомбинантных ДНК Лекция 3 С

подготовленных к.б.н. Фесенко И.А

фага  в небольшую (5 kb) плазмиду. Клонирование осуществляют в

E. coli.


BAC (Bacterial Artificial Chromosome) – векторы (кольцевые), созданные на основе бактериальной
F-плазмиды. Клонирование осуществляют в Е. coli.


YAC (Yeast Artificial Chromosome) – векторы (линейные), представляющие собой искусственную дрожжевую хромосому, в состав которой входит дрожжевые ориджин репликации, теломеры, центромеры и вставленный участок геномной ДНК животного. Клонирование осуществляют в дрожжевых клетках.

перенос
одноцепочечных фрагментов ДНК
(блоттинг)
Фрагмент ДНК, комплементарный ДНК-зонду

гена

Дородовая диагностика наследственных болезней
Серповидноклеточной анемия – нуклеотидная замена в β-цепи

гемоглобина GAG на GTG
ДНК здорового плода ДНК плода с
серповидноклеточной анемией

GAG

GTG

GAG

GTG

иРНК, комплементарная ДНК-зонду

или делать много копий, небольших фрагментов ДНК
Полимеразная цепная реакция

была изобретена в середине 80-х годов имела революционное значение для молекулярной биологии, медицинской диагностики, судебной экспертизы, эволюционной биологии и мн.др.

Cary Mullis во время вручения
Нобелевской премии в 1993

однонитевая ДНК-матрица (получают нагреванием раствора ДНК)

точка начала копирования определяется

с помощью праймеров

ДНК-полимераза использует нуклеотиды для строительства новых
цепей

ДНК, образующий затравку на ДНК-матрице

этапе создается одноцепочечная ДНК, при температуре 940С
Отжиг праймеров – на

этом этапе праймеры гибридизуются с матричной ДНК, создавая затравку

Элонгация – на этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новые цепи (при температуре 720С)

дают огромное количество ДНК

чувствителен к температуре и разрушается при денатурации ДНК.
Важное усовершенствование техники

ПЦР произошло после открытия бактерий, живущих в горячих источниках. ДНК-полимераза этих бактерий работает при температуре 720С.

ДНК-полимераза выделенная из этих бактерий называется Taq-полимераза.

Начальный материал для ПЦР это небольшое количество ДНК ( может быть даже одна молекула ДНК) , содержащая нуклеотидную последовательность, которую необходимо клонировать.

возбудителя и прямо указывает на возбудителя инфекции
Области применения ПЦР

и вирусы даже в тех случаях, когда другими методами их

выявление невозможно.

3. Высокая специфичность – в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК

4. Быстрота получения результата – определение возбудителя занимает около 1 дня

5. Работа с любым биологическим материалом – возможна детекция в материале полученном от больного животного

6. Безопасность работы с исследуемым материалом – материал может быть дезинфицирован перед работой

лекарственных препаратах. Разработаны наборы для диагностики загрязнения сальмонеллой, стафиллококом, листерией.

В ветеринарии используют наборы для определения туберкулеза, сибирской язвы, чумы свиней, чумы плотоядных, хламидиоза, микоплазмоза у птиц, бешенства

Срок диагностики составляет 8-10 часов

Например, из листьев растения обнаруженных в пластах миоцена (около 18

млн.) была выделена ДНК и использована для ПЦР. Была клонирована часть гена 1,5-рибулозобифосфат карбоксилазы. На основе данных о нуклеотидном составе этого участка растение было отнесено к семейству Магнолиевых

является разработка молекулярно-генетических маркеров, тесно сцепленных с главными генами хозяйственно-ценных

признаков

Молекулярные маркеры позволяют получать информацию об изменчивости генов и выявлять отдельные гены и генные ансамбли, несущие желательный комплекс признаков

определенных генов и локализации их относительно друг друга
хромосома
хромосома
ценный ген
ПЦР

– продукт определенной длины

Нет ПЦР продукта

место и ресурсы


-признаки, например устойчивость к болезням могут быть

оценены вне зависимости от наличия инфекции


-ДНК-маркеры выявляют полиморфизм в ДНК, поэтому возможно исключить влияние окружающей среды на выражение признака

Удобный ДНК-маркер должен обладать следующими признаками:

должен быть дешевым и легко используемым
тесно сцеплен с маркируемым признаком
должен выявлять гетерозиготы (быть кодоминантным)

молока выделяют группу генов вносящих наибольший вклад в этот количественный

признак:

S1-казеин, -казеин, -лактоглобулин

Аллель – одна из двух (или нескольких) альтернативных структурных форм гена

Для получения молока, идеального для производства сыра, необходимо проводить селекцию коров по таким генотипам:

S1 – казеин СС (плотный сгусток)
 - казеин ВВ или СС (хорошое сычужное свертывание)
- лактоглобулин ВВ (высокая массовая доля казеина)

каждой породы имеется свой набор генетических маркеров, которые выявляются с

помощью ПЦР

1,6 исходные родители
2-5 потомство

между разными странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также

заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у представителей коммерческих пород

У телят голштинской породы недавно обнаружена генетическая болезнь BLAD – дефецит адгезивности лейкоцитов.
Единственным существующим в настоящее время методом, позволяющим безошибочно выявить носителей мутантного гена, является ПЦР-анализ, с последующей рестрикцией.
Установлено, что 15% племенных быков голштинской породы в Америке является носителем данной мутации.
Ежегодные убытки в результате гибели больных телят составляют
5 млн. долларов

исследованиях.ПЦР применяется в эволюционной биологии, клонировании генов, мутагенезе in vitro,

изучении структуры геномов и многих других исследованиях

ДНК, секвенирование ДНК, ПЦР и получение кДНК.

2.

Как можно выделить определенную последовательность ДНК из геномной ДНК?

3. Фрагмент ДНК имеет следующую последовательность 3’-GGCGTATTC-5’. Он отсеквенирован с помощью ферментного метода. Сколько бэндов всего будет на геле? Сколько бэндов и каков их размер будет при электорофорезе в каждой из четырех смесей?

дот-блоттингами?

5. Какие последовательности ДНК содержит библиотека кДНК?

6.

Можно ли последовательность белка определить с помощью библиотеки геномной ДНК?

7. Как иРНК может быть переведена в кДНК?

8. Будет ли зависеть ПЦР продукт от: а) направленности праймеров, б) сиквенса праймеров, в) Тm праймеров?