Слайд 1Аппарат гольджи
Сердце секреторного пути
Слайд 2Движение грузов: модели
Модель 1: везикулярный транспорт (разработана по клетках человека
и животных)
Модель 2: мембранный континуум (основана на данных ЭМ о
соединениях ЭПР и АГ у растений)
Модель 3: созревание цистерн (разработана на простейших)
Брефельдин А – ингибитор секреции
(блокирует формирование COP-комплекса)
Слайд 3ULLA NEUMANN et al. Ann Bot 2003;92:167-180
©2003 by Oxford University
Press
Как выглядит АГ?
Фотография АГ из корневого чехлика табака (а) –
«вид в разрезе», и апикальной меристемы корня кукурузы (б) – «вид сверху».
Транс-Гольджи
200 нм
Слайд 4ULLA NEUMANN et al. Ann Bot 2003;92:167-180
©2003 by Oxford University
Press
Как расположен АГ?
АГ (красн.) и ЭПР (зел)
АГ(зел) и микрофидаменты (красн.)
Слайд 5Что держит цистерны вместе?
Каждый АГ состоит из 5-8 цистерн.
ribosome-exclusion zone
– зона вокруг АГ, не содержащая рибосом (выявлена с помощью
ЭМ)
Считается, что эта зона заполнена неким матриксом, который обеспечивает скрепление цистерн.
В этом процессе также участвуют интерцистернальные элементы. Так назвали плотные структуры между транс-цистернами.
Слайд 6Гольджины
Белки матрикса, которые, естественно, были обнаружены сначала у животных.
Детально их
функции неизвестны, главная – структурная: связь между цистернами.
Гомологи нескольких гольджинов
обнаружены у растений
Отсутствует та группа, которая у животных отвечает за распад АГ в митозе на отдельные цистерны
Возможно, поэтому к растений АГ сохраняет целостность в процессе митоза.
Слайд 7ЭПР и АГ: работа в команде
У растений есть существенные отличия
в транспорте грузов между ЭПР и Гольджи:
Они гораздо ближе друг
к другу, между ними отсутствует посредник – ERGIC (ER–Golgi intermediate compartment) и микротрубочки, которые к нему ведут.
ERES (ER exit sites) и Гольджи тесно ассоциированы друг с другом и находятся совсем рядом.
Слайд 8Животные и растения: почему так?
У животных АГ находится неподалёку от
ядра. ER exit sites (ERES) распределены по поверхности ЭПР и
сконцентрир. около ядра – ближе к АГ.
У растений АГ находятся по всей кортикальной цитоплазме и движутся вдоль ЭПР, тесно связанные с ERES.
ERES – красн.
ER – зел.
Слайд 9Fig. 3.
ULLA NEUMANN et al. Ann Bot 2003;92:167-180
©2003 by
Oxford University Press
ЭПР и Гольджи: опять модели
Три модели взаимодействия ЭПР
и Гольджи:
Пылесос – Гольджи движется вдоль ЭПР, «собирая» груз. Экспорт происходит в любом месте.
Стоп-пошёл: Гольджи движется, пока не получает сигнал остановиться и забрать груз.
Мобильные сайты экспорта: движутся и Гольджи, и сайты «выдачи груза» в составе ЭПР.
Слайд 11Отцы и дети…
Ряд авторов рассматривает АГ как «потомка» ЭПР.
В принципе,
это не влияет на изучение его строения и функций, однако
включает в себя эволюционный и онтогенетический аспект.
Эту гипотезу подтверждают работы, в которых нарушали формирование АГ, и тогда АГ-резиденты оставались в «отчем доме» – в ЭПР.
Слайд 12COP1 и COP2: на раз, два…
Сoat protein complex II обеспечивает
основной поток грузов - антероградный транспорт ЭПР – Гольджи.
СОР1 обеспечивает
ретроградный транспорт ЭПР-резидентов, имеющих сигнальную последоват. K/HDEL.
В слиянии пузырьков принимают участие SNARE: vesicular (v-SNAREs) и target (t-SNAREs)
Заякоривание происходит с помощью «тросов» (Tether)
Слайд 13Белки COP2 – молекулярные клетки
Подвижная (гибкая) архитектура
Формируют правильные многогранные «клетки»:
24-гранные и 60-гранные
При определенных условиях могут становиться почти плоскими.
Такая гибкость
важна для формирования/
Рециклирования везикул
Organization of the ER–Golgi interface for membrane traffic control
Federica Brandizzi & Charles Barlowe
Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 382-392 (June 2013)
Слайд 15ULLA NEUMANN et al. Ann Bot 2003;92:167-180
©2003 by Oxford University
Press
Иммунофлуоресценция использовалась для изучения локализации белков АГ:
ARF1 (малая ГТФаза, компонент
COP1-комплекса)
COP1
VSR (маркёр превакуолярных органелл)
Rab2 (малая ГТФаза)
Слайд 16«Дозревание» белков, предназначенных для секреторного пути (гликозилирование)
Биосинтез полисахаридов клеточной стенки
и ферментов, обеспечивающих её формирование
Сортировка и упаковка грузов
Дозревание липидов
Рециклирование мембран:
ПМ, ЭПР, вакуолярной системы.
Функции аппарата Гольджи
Золотом помечены ксилоглюканы (большое) и пектины (малое)
Слайд 17Chris Hawes, Béatrice Satiat-Jeunemaitre
The plant Golgi apparatus—Going with the
flow
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research,
Volume 1744, Issue 2, 2005, 93–107
Слайд 18Гликозилтрансферазы
Задача – манипуляции с углеводным компонентом:
- N-гликозилированных пептидов
- Будущих полимеров
клеточной стенки
Это трансмембранные белки с активным центром в люмене АГ.
В
одной и той же цистерне могут идти различные реакции.
Ферменты организуются в комплексы за счет белок-белковых взаимодействий.
Слайд 19Ai Oikawa, Christian Have Lund, Yumiko Sakuragi, Henrik V. Scheller
Golgi-localized enzyme complexes for plant cell wall biosynthesis
FUT, a-1,3-fucosyltransferase;
GALT1, b-1,2-galactosyltransferase;
GnT, N-acetylglucosaminyltransferase; M
an, a-1,2-mannosidase;
XylT, b-1,2-xylosyltransferase.
CSLC4, cellulose synthase-like C4;
FUT1, xyloglucan a-1,2-fucosyltransferase 1;
MUR3, xyloglucan b-1,2-galactosyltransferase;
XLT2, xyloglucan position 2-specific b-1,2-
galactosyltransferase
XXT1, xyloglucan a-1,6-xylosyltransferase 1.
Слайд 20Маннозидаза I
отщепление 4 молекул маннозы
GlcNAc-трансфераза I
присоединяет N-ацетилглюкозамин к
одной из оставшихся молекул маннозы;
Маннозидаза II отщепляет еще два
маннозных остатка;
Присоединение фукозы, ксилозы и второй молекулы ацетилглюкозамина
GlcNAc-трансферазой II
Слайд 22Биосинтез полисахаридов КС: гликанов и пектинов
Слайд 23Гликан синтазы– основная цепь
Гликозилтрансферазы- боковые цепи
CSL – cellulose synthase like
Синтезы
на ПМ и в АГ: аналогия?
?
Слайд 24Гликозилтрансферазы могут иметь каталитическую часть на С-конце в люмене, трансмембранный
домен (ТМД) и N-конец в цитозоле
Другие белки имеют несколько ТМД.
Между
собой они взаимодействуют через цистеиновые остатки или нековалентные взаимодействия.
Это помогает заякориваться некоторым ферментам, лишенных ТМД.
Это помогает создавать мультифункциональные комплексы
Это обеспечивает регуляцию активности ферментов
Одни и те же ферменты могут входить в состав разных комплексов
Слайд 25Методы
Как изучать направления и пути транспорта?
Слайд 26FM 4-64
Этот флуоресцентный краситель липофилен, поэтому связывается с плазматической мембраной
и проникает в клетку только путём эндоцитоза, а затем рециклирует,
возвращаясь к ПМ.
Таким образом, следя за движением метки, можно наблюдать «маршрут» везикулярного транспорта.
Слайд 27BFA-bodies: ингибиторный анализ
Давным-давно для изучения секреции начали использовать Брефельдин А
– «ингибитор секреции».
Он останавливает транспортные процессы, приводя к образованию БФА-телец,
или агрегатов.
Изучение этих телец предоставляет массу информации о связи между органеллами эндомембранной системы.
Например, тельца из АГ и ТГС лежат отдельно, и те белки, которые шли по пути эндоцитоза, остаются в ТГС, но не в АГ.
Слайд 28Брефельдин А
Механизм действия этого ингибитора грибного происхождения на данный момент
детально изучен:
Он предотвращает активацию ГТФазы ARF1 за счет блокирования фактора
обмена нуклеотидов (GEF).
При этом практически все эндомембранные структуры оказываются в составе BFA-телец.
Слайд 29Как изучать белок-белковые взаимодействия?
Выделение и очистка
коиммунопреципитация
идентификация с помощью антител
Электрофорез
две половинки
соединяются при взаимодействии
передача энергии
Трансформация дрожжей или растений
Слайд 30Пост-гольджи транспорт
Секреторный путь. Эндоцитозный путь. Дополнительные органеллы.
Слайд 31Транс Гольджи Сеть
Также носит название «ЕЕ» (early endosome)
Движется независимо от
АГ и лишь временно останавливается около одного из комплексов
Участвует в
рециклировании мембран
Через TGN проходят белки как экспортные, так и идущие в вакуоль на деградацию.
Слайд 32Мобильная и независимая
Corrado Viotti et al. Plant Cell 2010;22:1344-1357
©2010 by
American Society of Plant Biologists
ТГС движутся, отмечены события взаимодействия как
с АГ, так и между собой (гомотипичная ассоциация)
Отмечены случаи «диссоциации»
Происхождение ТГС от АГ подтверждено ингибиторным анализом.
Слайд 33Откуда и куда?
C помощью иммуноцитохимии было показано, что через ТГС
проходят все белки секреторного пути
Также через ТГС проходят все белки,
попавшие в клетку путём эндоцитоза и направляющиеся на деградацию в превакуолярный компартмент.
Слайд 34Сложные пути эндосом
ТГС принимает посылки от ПМ, посланные путём эндоцитоза
Рециклирование
мембранных белков происходит минимум 2-мя путями с помощью «рециклирующих эндосом».
В
ПВК попадают белки как из АГ (новые), так и из эндосомных компартментов (старые).
Traffic Volume 9, Issue 10, pages 1589-1598
Слайд 35ПреВакуолярный Компартмент
ПВК получил свое второе название МВТ – мультивезикулярное тело
- благодаря своей способности образовывать «внутренние везикулы» (с помощью ESCRT).
Они содержат белки ПМ, подлежащие деградации.
После слияния с вакуолью эти везикулы постепенно разрушаются.
Ретромерный комплекс служит для выявления и рециклирования служебных белков - рецепторов вакуолярных грузов. Они возвращаются в ТГС.
Слайд 36ПВК удалось «увидеть»
Аппараты Гольджи + ТГС
DV – dense vesicles
– несут запасные белки в вакуоль
CCV – clathrin-coated vesicles –
выполняют все остальные перемещения
MVB – превакуолярный компартмент
Ниже – ПВК, содержащие агрегаты запасных белков и внутренние везикулы.
ПВК образуются при слиянии везикул АГ, содержащих запасные белки (DV) и протеазы (CCV).
Traffic
Volume 9, Issue 10, pages 1589-1598, 9 JUL 2008 DOI: 10.1111/j.1600-0854.2008.00787.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-0854.2008.00787.x/full#f4
Слайд 37Значение эндоцитоза
Эндоцитоз и эндосомы играют ключевую роль в дифференциации зародыша,
гравитропизме, дифференциация эпидермиса, устьичных движениях, защите от патогенов и др.
Особенность
растительных клеток - в разнообразии транспортных путей и вакуолей. Это ведёт к увеличению количества белков, участвующих в процессах, и к их многофункциональности.
Конститутивное рециклирование – постоянный трафик между эндосомой и ПМ, поддерживающий состав белков ПМ.
Идуцибельное рециклирование – в ответ на сигнал, например, гормональный, - позволяет быстро изменять состав белков ПМ.
Слайд 38Конститутивное рециклирование
Наиболее изученный пример у растений – белки транспорта ауксина
AUX1 и PIN1.
Используются 2 разных пути: BFA-чувствительный и BFA-нечувствительный.
BFA‐insensitive
BFA‐sensitive
Слайд 39Индуцибельное рециклирование
Эндоцитоз белка К+-канала КАТ1 индуцируется абсцизовой кислотой (АВА).
Количество белка
в плазмалемме снижается, в эндосомах – растет.
Следствие – закрывание устьиц.
Current Biology
Volume 17, Issue 16, 21 August 2007, Pages 1396-1402
Н-АТФаза
КАТ1
Слайд 40На деградацию!
Сортировка белков ПМ в эндоцитозные везикулы и далее во
внутренние везикулы ПВК – важный этап отрицательной регуляции рецепторов, вовлеченных
в физиологические процессы.
Инвагинации в ПВК – особый случай образования везикул, поскольку во всех остальных случаях везикулы формируются в цитоплазме.
Для образования инвагинации нужно проставление метки – убиквитинирование белка-рецептора.
Слайд 41Как образуются «внутренние везикулы»?
Образование везикул обеспечивает endosomal sorting complex required
for transport (ESCRT).
Меченый убиквитином рецептор попадает в эндосому и инициирует
сборку клатриновой шубы.
В этом участвует комплекс ESCRT и АТФаза Vps4p/SKD1, которая в АТФ-связанной форме прикреплена к мембране, а в АДФ-связанной – растворима.
Слайд 42Как образуются «внутренние везикулы»?
Traffic
Volume 9, Issue 10, pages 1589-1598
Экспрессия SKD-1
в ответ на стресс.
В клетках, экспрессирующих SKD-1, увеличенные МВТ
Они образуют
больше впячиваний (белые стрелки) – образование внутренних везикул
Слайд 43Эндосомы и сигналинг
Эндоцитоз не только помогает убирать с поверхности активированные
рецепторы
Он также может доставлять эти рецепторы к тому месту, где
сигнал будет передан и усилен.
Пример: FLS2 (flagellin sensing) и BRI1 – киназы, которая активируются в ответ на заражение и брассиностероид, соответственно.
Эти рецепторы инициируют вторичный ответ после эндоцитоза.
Слайд 44Niko Geldner, and Silke Robatzek Plant Physiol. 2008;147:1565-1574
©2008 by American
Society of Plant Biologists
Эндосомы и сигналинг
Модель эндоцитоза BRI1 и FLS2
с участием корецептора BAK1. Эндоцитоз происходит сходным образом.
Но! после ранней эндосомы их пути разделяются: flg22 - в вакуоль на деградацию, BRI1 – на рециклирование.
Слайд 45Происхождения эндосомного сигналинга
«Столпотворение»? рецепторам не хватает места на поверхности клетки;
эндоцитоз создаёт дополнительные «посадочные места».
«Активное перемешивание»? Рецепторы находятся далеко от
ядра, и трансдукция сигнала зависит от диффузии; эндоцитоз превносит активную компоненту («доставка сигнала»).
Слайд 46Вакуоли: 2 или 1
Известно 2 основных типа вакуолей: LV (литическая)
и PSV (белок-запасающая). Их локализацию изучали с помощью GFP-слитых аквапоринов-маркёров
α-TIP (PSV) и γ-TIP (LV) или антител к ним.
Белки, которые направляются в литическую вакуоль, имеют сигнальную последовательность ssVSSs, которая взаимодействует с рецептором семейства вакуолярных сортеров (VSR).
Белки, предназначенные для хранения, имеют другой сигнал (ctVSSs), который связывается с другим рецептором (RMR).
Слайд 47Иногда их чётко 2
Алейрон в литической вакуоли
Лектин ячменя в запасающей
вакуоли
α-TIP (PSV) – красные,
TIP-МА27 (LV) - зеленые
Слайд 48А иногда всего 1…
Например, центральная вакуоль в корнях, листьях и
зародыше Арабидопсиса содержит оба маркёра.
Предполагают, что разные типы вакуолей чаще
всего содержатся либо в разных типах клеток, либо в конце концов сливаются, формируя центральную вакуоль
Слайд 49Вспомним, зачем нужны вакуоли?
поддержание тургора
гомеостатирование цитоплазмы
запасание продуктов метаболизма
изолирование ксенобиотиков
разложение компонентов
цитоплазмы
защита от патогенов и травоядных
пигментация
