Физиология микроорганизмов, стерилизация

вирусологии




Физиология микроорганизмов, их химический состав, питание и его обеспечение в

лабораторных условиях.
Стерилизация



д.м.н., проф. Шаркова В. А.

размножение В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ - метаболизм

соединений на простые
низкомолекулярные
Часть из них выводится из клетки, часть

используется клеткой для биосинтетических реакций и включаются в процессы ассимиляции

клетки и других структур органов и тканей. Анаболизм обеспечивает рост,

развитие, обновление биологических структур, а также непрерывный ресинтез макроэргических соединений и их накопление

Катаболизм —совокупность процессов расщепления сложных молекул, компонентов клеток, органов и тканей до простых веществ (с использованием части из них в качестве предшественников биосинтеза) и до конечных продуктов метаболизма (с образованием макроэргических и восстановленных соединений)

Взаимосвязь процессов катаболизма и анаболизма основывается на единстве биохимических превращений, обеспечивающих энергией все процессы жизнедеятельности и постоянное обновление тканей организма

растворителем химических соединений, служит дисперсной средой для коллоидов Содержание СВ изменяется

в зависимости от условий внешней среды, физиологического состояния клетки, возраста

в цитоплазме, нуклеоиде, входят в состав клеточной стенки
К белкам принадлежат

ферменты, токсины

и 80S.
Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов
Антибиотики не

действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов

углерода. Распределены в клеточной оболочке, капсуле, др.

м.б. связаны с углеводами и белками. Участвуют в энергетическом обмене

ферментов, АТФ – аккумулятора Е в клетке Na – участвует

в поддержании осмотического давления в клетке Mg – входит в состав рибонуклеината магния, локализован- ного на поверхности Гр- бактерий Fe – содержится в дыхательных ферментах МЭ - участвуют в синтезе и активации ферментов

катализаторы

катализирует одну или близкие хим. реакции)
Активность зависит от

t среды (37-50 град.С), рН (7,2-7,4), др.

Ферментный состав МКО – достаточно постоянный признак

атомов
Гидролазы - гидролитическое расщепление различных соединений
Лиазы -катализируют реакции отщепления от

субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.
Изомеразы- определяют пространственное расположение групп элементов
Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

группы ферментов
Конститутивные ф. – синтез происходит постоянно (ферменты клеточного обмена

-протеазы, липазы, карбогидразы, др.)
Индуктивные ф. (адаптивные) – синтезируются в кл-ке под влиянием соответствующего субстрата, находящегося в питательной среде и, когда МКО вынужден его усваивать
Репрессибельные - синтез которых подавляется избытком продукта реакции

органических
Эндоферменты - участвуют в реакциях обмена веществ, происходящих внутри

клетки

конечные продукты и результаты действия ферментов.
микробиологическая (рабочая)

классификация ферментов
Сахаролитические
Протеолитические
Аутолитические
Окислительно- восстановительные
Ферменты патогенности (вирулентности).

и качества готовой продукции)
В с/х (получение высококачественных кормов, белково-витаминных концентратов)
В

промышленности (борьба с метаном в шахтах, био добавки в стиральные порошки)
В медицине (получение витаминов, гормонов, алкалоидов)

МКО
Высокая скорость метаболических реакций (За сутки одна клетка перерабатывает питательных

веществ в 30-40 раз больше собственной массы)
МКО быстро адаптируются к изменяющимся условиям среды обитания

в виде простых молекул веществ
Голозойный – способность заглатывать и переваривать

плотные частички пищи за счет их гидролиза с помощью пищеварительных ферментов. Процесс происходит вне клетки. В результате образуются простые водорастворимые молекулы, проникающие через клеточную стенку и цитоплазму

сложные органические вещества из простых неорганических соединений (двуокись С или

карбонаты). Способны расти в чисто минеральной среде

Органотрофы (Гетеротрофы)– нуждаются в готовых органических соединениях (усваивают С из углеводов, многоатомных спиртов, органических кислот, АК)

- сапрофиты (питаются мертвым органическим материалом, независимы от др. организмов)
- паразиты (зависимы в получении питат. веществ от хозяина, м.б. облигатными, факультативными)

белка клетки используют молекулярный N воздуха или усваивают его из

аммонийных солей
Аминогетеротрофы – получают N из органических соединений – АК, сложных белков

энергию солнечного света
Хемотрофы – получают Е за счет окисления неорганических

веществ и органических соединений

Гетерохемоорганотрофы, прототрофы – МКО, у которых источник С является и источником Е

готовом виде, входят в состав ферментов, играют роль катализаторов в

биохимических процессах:

Витамины
АК (для синтеза белка)
Пуриновые и пиримидиновые основания (для построения НК)

диффузия – по градиенту концентрации (С вещества и осмотическое Р

по обе стороны выравниваются) – С вещ-ва в среде > С его в клетке
Облегченная диффузия – с помощью пермеаз (молекулы-переносчика – фермент, локализованный на ЦПМ, обладает специфичностью) без затраты Е
Активный транспорт – с участием пермеаз с затратой Е (С в-ва в кл-ке > С в среде )
Транслокация химических групп – перенос радикалов
(в-во подвергается химической модификации)

Выход в-в из МКО:
Пассивная диффузия
Облегченная диффузия

на средах МКО осуществляют все жизненные процессы : питание,

дыхание, размножение и др.

ионов
Изотоничность
Стерильность
Влажность
Унифицированными
Обладание окислительно
восстановительным
потенциалом

микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих

МОК (соли желчных кислот, подавляя рост Е. coli, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных АБ, солей, изменения рН
среды накопления - жидкие элективные среды (пептонная вода с рН 8,0 – активно размножается холерный вибрион, др. МКО не растут)
дифференциально-диагностические среды - позволяют отличить (отдифференцировать один вид МКО от другого по ферментативной активности:
А) углеводолитические: среды Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева (состав, цвет колоний)
Б) для определения протеолитической активности: расщепляют белки с выделением H2S, индола, аммиака на средах - МПБ, с молоком, желатином, сывороткой
В) для определения гемолитической активности - среды с кровью (КА)
консервирующие среды – для первичного посева и транспортировки исследуемого материала (предотвращают отмирание патогенных МКО, подавляют развитие сапрофитов: глицериновая смесь для сбора испражнений и последующего исследования с целью обнаружения ряда кишечных бактерий)

Среда Олькеницкого
(трехсахарная среда с

мочевиной) -для накопления и дифференциации энтеробактерий

Среда
Вильсон-Блера

уникальных ферментов микроорганизмов

В состав среды включены хромогенные субстраты –

вещества, при расщеплении которых образуются окрашенные продукты.
В результате хромогенная среда контрастно изменяет свой цвет при обнаружении искомого микроорганизма

Большинство хромогенных сред содержат селективные добавки, подавляющие рост нежелательных бактерий

albicans, C. tropicalis, C. Krusei
«Liofilchem» (Италия)

Хромогенная среда
Coli/Coliform -

для выделения и
подсчета E. coli и
колиформных бактерий

среда Strepto В -
для выделения стрептококков группы В (Streptococcus agalactiae)

Хромогенная среда Detection
Позволяет одноэтапно и одновременно выделять и
идентифицировать бактерии:
- E. сoli
- Proteus mirabilis
- S.aureus
- Enterococcus faecalis
- Klebsiella pneumonia
- Pseudomonas aeruginosa

Salmonella spp.
Принцип:
Протеозный пептон и мясной экстракт обеспечивают наличие

аминокислот и белков. Дрожжевой экстракт является источником аминокислот и витаминов группы В. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс среды. Специальная хромогенная смесь обеспечивает дифференциацию Salmonella spp. от других колиформных и неколиформных бактерий на основе цвета и морфологии колоний. Хромогенная смесь также ингибирует грамположительные микроорганизмы. Добавка Tween 20 увеличивает микробный рост

Salmonella typhimurium и другие виды сальмонелл будут выявляться ростом окрашенных колоний розовато-лилового цвета. Citrobacter и другие колиформы - в виде сине-зеленых колоний. Некоторые МКО, которые не гидролизуют хромогенные смеси, могут давать рост в виде бесцветных колоний. Конечная идентификация может быть осуществлена с помощью биохимических и/или серологических тестов

селективные свойства благодаря хлориду лития и смеси антибиотиков, состоящей из

цефтазидима, полимиксина В, налидиксовай кислоты и циклогексимида. Дифференциация происходит благодаря присутствию в среде хромогенной смеси Х-глюкозида в качестве субстрата для детекции фермента β-глюкозидазы, общего для всех видов Listeria. Специфическая дифференциальная активность получена с помощью субстрата L-α-фосфатидилинозит для фермента фосфолипазы С, который продуцируют Listeria monocytogenes


Интерпретация результата:
Благодаря комбинации двух субстратов происходит дифференциация колоний Listeria spp., которые имеют сине-зеленый цвет, от колоний Listeria monocytogenes, которые имеют сине-зеленый цвет и окружены матовым ореолом

хромагары для визуальной дифференциации микроорганизмов

СHROMagarTM Candida: среда для выделения и

идентификации Candida albicans, C. tropicalis иC. krusei. Среда ингибирует рост бактерий и также может использоваться в качестве селективной среды для выделения других видов дрожжей и мицелиальных грибов

СHROMagarTM Orientation: среда для выделения, прямого определения, дифференцирования и подсчета патогенных микроорганизмов мочевыводящих путей. Позволяет дифференцировать и идентифицировать E. coli и Enterococcus spp без выполнения подтверждающего теста

CHROMagarTM Salmonella: селективная и дифференциальная среда для выделения и предварительной идентификации видов Salmonella

зоны в «чистую»

среды

инструментов

аппарате Коха)
Жаром (сухим горячим воздухом в печах Пастера, t до

160 град.)

радиоактивных изотопов, электронным излучением с пом. ускорителя электронов)
Фильтрование через

мелкопористые фильтры (керамические, асбестовые, стеклянные, мембранные ультрафильтры из коллоидных растворов нитроцеллюлозы)
тиндализация (дробная стерилизация) – многократное прогревание на водяной бане

и бромистого метила в соотношении 1:2,5 и формальдегида)
плазма, озон

озоновый "Озон СП-5". Стерилизация производится озоно-воздушной смесью, продуцируемой генератором озона

из атмосферного воздуха. Однако, окислительная способность озона и ограничивает его спектр применения. При контакте с ним могут повреждаться изделия из стали, меди, резины и др., озон токсичен, а имеющиеся сегодня аппараты не позволяют обезопасить персонал от контакта с ним. Повторяемость метода до сих пор под вопросом. Для контролирования процесса существуют только индикаторы первого класса (свидетели процесса)

не имеющих полостей, каналов и замковых частей: инструмент погружается в

среду мелких стеклянных шариков, нагретых до температуры 190 - 290С (таким образом, чтобы над рабочей поверхностью инструмента оставался слой шариков не менее 10 мм) на 20 - 180 секунд, в зависимости от размера и массы инструмента. Этот метод используется, в основном, стоматологами для экспресс-стерилизации мелких инструментов - боров, пульпоэкстракторов, корневых игл, алмазных головок и др., а также рабочих частей более крупных - зондов, гладилок, экскаваторов, шпателей и т.д

40°С. В качестве стерилизующего агента используются пары водного раствора пероксида

водорода и низкотемпературная плазма (ионизированный газ, образующийся при низком давлении)
сохран. молекулярной структуры инструментов из полимерных материалов)
Действуют фотонами ультрафиолетового излучения и радикалами (атомы или группы атомов с неуравновешенными электронными облаками и поэтому химически активные, как например O и OH). 35-70 мин

- УФ-излучение возникает при электрическом разряде

три установки разного объема: 50, 100 и 200 литров. Более

95% медицинских изделий могут подвергаться стерилизации в этих установках

Не подлежат стерилизации плазмой изделия из полиамида, некоторые сульфиды, хирургическое белье, перевязочный материал, изделия из целлюлозы, порошки, жидкости

плазменный метод приемлем для стерилизации уникальных термолабильных изделий, имеющихся в единичном экземпляре и используемых неоднократно в течение рабочего дня

сочетании с низкотемпературной плазмой, представляющей собой продукты распада пероксида водорода

(гидроксильные группы ОН, ООН), образующиеся под воздействием электромагнитного излучения с выделением видимого и ультрафиолетового излучения. Пероксид водорода и плазма не обладают такими проникающими способностями, как этиленоксид, но имеют большое преимущество - распадается на нетоксичные продукты - воду и кислород, не оказывая вредного воздействия на окружающую среду. Стерилизация проводится при температуре 46 - 500С за 54 - 72 минуты На сегодняшний день отсутствуют общепризнанные международные стандарты для данного метода. Имеются определенные ограничения в отношении стерилизации материалов, содержащих целлюлозу и каучук. Высокая стоимость оборудования и расходных материалов сужает спектр применения данного метода стерилизации. Кроме того, стерилизация полых многоканальных изделий требует применения дополнительных расходных приспособлений

160-170град., 120 мин.
перевязочный материал, питательные среды простые – 120 град.

(1 атм), 20 мин.
Жаром стерилизуют лабораторную посуду, инструменты (1 час)
Сложные среды с углеводами, молоком, желатином – в аппарате Коха 100 град. 30-60 мин. 3 дня
Белковые среды плотные – 58 град. 1 час 3 дня
Белковые жидкие – водяная баня 58 град. 1 час 3-4 дня

в присутствии пара при 80град в камерах
Лучевая стерилизация – в

промышленных условиях при стерилизации большого числа предметов (шприцы, системы для переливания крови)
Фильтрование – сыворотки крови, лекарственные жидкие препараты

образца – 20 суток;
при открытом биксе любого образца стерильность

материалов, изделий сохраняется до 24 часов;
крафт-пакеты, заклеенные – 20 суток;
крафт пакеты на скрепках – 3 суток.
При открытом крафт-пакете материалы и изделия должны быть использованы сразу

Стерильность материалов, изделий, сроки сохранения

манометра)
Химический – с помощью химических индикаторов, меняющих цвет или плавящихся

при определенной t, влажности (антипирин, сахар, индикаторные бумажки, бензойная кислота, мочевина, запаянная в ампулы)

в термостат, биологические индикаторы стерилизации (БИ)

Биологический индикатор представляет собой препарат

из патогенных спорообразующих микроорганизмов, с известной высокой устойчивостью к данному типу стерилизационного процесса

потенциально патогенных для человека МКО на объектах внешней среды

При этом

споры, вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии

степень - уничтожение аспорогенных форм бактерий, микоплазм, риккетсий, простейших

В степень

- уничтожение грибов, аспорогенных форм бактерий, характеризующихся повышенной устойчивостью

Степень С – уничтожение возбудителей ООИ и вирусов

Степень D – спор и цист простейших

микробной контаминации
Цель – разорвать или затормозить процесс передачи возбудителя от

источника инфекции к восприимчивым людям
Заключительная – по окончании работы, после госпитализации больного
Цель – полное уничтожение возбудителя на всех объектах очага

пастеризация (60-70 град., 20-30 мин.) убивают все вегетативные формы бактерий

химический – 2% натрия гидрокарбоната (сода растворяет белки, жиры)
УФ-облучение – бактерицидные лампы (длина волны 200-400 нм)

60 мин или 4%-ный - 90 мин;
0,03%-ный раствор нейтрального

анолита - экспозиция 30 мин;
пресепт 0,056% - экспозиция 90 мин (10 таб. по 0,5 г);
лизол 5% - экспозиция 15 мин (50 мл препарата + 960 мл воды);
лизоформин 3000 1,5% - экспозиция 15 мин (20 мл препарата + 980 мл воды);
виркон 1% - экспозиция 10 мин (10 г препарата + 980 мл воды);
дезоформ - экспозиция 60 мин (10 мл препарата + 990 мл воды);
дезоформ 3% - экспозиция 30 мин (30 мл препарата + 970 мл воды);
дезоформ 5% - экспозиция 10 мин (50 мл препарата + 950 мл);
глутарал 2% - экспозиция 15 мин;
спирт 70%-ный - экспозиция 30 мин.

Благодарю за внимание