Лекция 13 Биосинтез белков (трансляция)

рибосом
свободные рибосомы
Рибосомы прикреплены к мембране ЭПР
Рибосомные субчастицы собираются из

предшественников в ядрышке эукариотической клетки. Там вновь синтезированные рРНК связываются с рибосомными белками, синтезированными в цитоплазме, и экспортируются в цитоплазму.

другу, и каждую секунду происходит соскакивание одной рибосомы у

3’-конца кодирующей части мРНК и посадка другой у 5’-конца.

Стадии инициации и терминации – это модификации стадии элонгации.
В полирибосоме одна мРНК ассоциирована со многими рибосомами, ее одновременно транслирующими (1:200).
При интенсивном белковом синтезе рибосомы в полирибосоме могут

структура тРНК Третичная структура

тРНК

A
C
C

Первое положение антикодона

связь

которые действуют друг за другом
Аминокислота триптофан отбирается кодоном UGG в

мРНК при участии триптофанил-тРНК-синтетазы
Ошибка на любой стадии будет приводить к включению «неправильной» аминокислоты в белок, что может привести к синтезу мутантного белка.

для каждой из 20 аминокислот имеется по одной АРСазе (есть

исключения – две изоформы LysRSазы у E.coli; некоторые прокариоты имеют меньше 20 ARSаз, модификация аминокислот происходит после их присоединения к тРНК););
одна и та же АРСаза аминоацилирует все изоакцепторные тРНК для данной аминокислоты;
активация аминокислот и аминоацилирование тРНК протекают сопряженно: АРСазы образуют промежуточные аминоациладенилат-ферментные комплексы;
АРСазы - обычно функциональные димеры (даже если структурные мономеры).

Дорибосомный этап белкового синтеза

Met

Gln
Trp

Glu
Tyr

Ile

Val

Ala

Lys

Asn

Phe

Asp

Pro

Gly

Ser

His

Thr

Класс

I

Класс

II

Позиционная

специфичность
аминоацилирования

2’

-

OH

рибозы

концевого А

тРНК

3’

-

OH

рибозы

концевого А

тРНК

Характерные His-Ile-Gly-His Три мотива с характерным
аминокислотные Lys-Met-Ser-Lys-Ser чередованием гидрофильных мотивы АРСаз и гидрофобных АК

СЕ структура в основном мономеры обязательно олигомеры

в основном с объемным в основном с небольшими гидрофобным радикалом нейтральными остатками

исключение

неглубокая выемка

глубокий узкий карман
на поверхности белка
Особенности структуры укладка Россмана 7 антипараллельных
активного центра бета-тяжей

Крупным радикалам легче связаться с неглубокой впадиной, а карман удобен для селекции мелких аминокислотных остатков. Различные группы активируемой аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами, формирующими активный центр фермента, что облегчает контроль и коррекцию связывания.
Последовательности, на которых основана классификация АРСаз, непосредственно участвуют в связывании АТФ.

тРНК связаны с ферментами классов I и II «разными боками»

структура тРНК Третичная структура

тРНК

A
C
C

Первое положение антикодона

располагаются именно в структуре Россмана и образуют часть АТФ-связывающего центра.
Положительно

заряженные остатки гистидина консервативного тетрапептида His-Ile-Gly-His взаимодействуют с фосфатными группами АТФ.

"Укладка Россмана" представляет собой шесть параллельных бета-тяжей, чередующихся с aльфа-спиральными участками

«неправильной» тРНК) приводят к одинаковому ошибочному результату:
Ех + Y +

тРНКх  Ех + Y-тРНКх
Ех + Х + тРНКy  Ех + Х-тРНКу

2. При отборе аминокислот в реакции аминоацилирования тРНК происходит каскадное усиление специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз: 
     Отбор за счет различий в энергии взаимодействия боковых радикалов аминокислот с аминокислотами активного центра АРСаз, т.е. правильная аминокислота имеет наиболее высокое сродство к «карману» активного участка своей АРСазы;
     Два последовательных дополнительных механизма коррекции: гидро-лиз «ошибочных» аминоациладенилатов и «ошибочных» аминоацил-тРНК.
3. Существуют также специальные механизмы контроля образующихся продуктов, например:
     Фермент D-тирозилгидролаза (специфический гидролиз D-тирозил-тРНКTyr);
Селективные системы деградации аномальных белков.

«Сверхспецифичность» аминоацил-тРНК-синтетаз

тРНК 1:40 000
тРНК при связывании с АРСазой, пытается

вытолкнуть аминокислоту во второй карман, точные размеры которого исключают правильную аминокислоту, но допускают введение близкородственных аминокислот.

При попадании аминокислоты в этот «участок редактирования», ее связь с АМР гидролизуется (или связь с самой тРНК, если связь аминоацил-тРНК уже образовалась к тому времени) и она высвобождается из фермента.

своей АРСазой, как «притягательные», а остальными 19-ю АРСазами, как «отталкивающие».
Отбор

«правильных» тРНК

Двойственные требования к структуре тРНК:
для универсальной адапторной функции необходимы сходные элементы структуры (L-форма);
для узнавания 20-ю специфическими аминоацил-тРНК-синтетазами и специфического аминоацилирования (акцепторные функции) необходимы уникальные элементы распознавания.

но не в случае, если аминокислота имеет 6 кодонов;
нуклеотид-«дискриминатор»

в положении 73 (А – для гидрофобных АК, G – для полярных АК) – есть у всех тРНК;
первые три пары нуклеотидов акцепторного стебля (от одной до трех): 1-72, 2-71, 3-70;
в некоторых случаях неконсервативные нуклеотиды D- и T-петель.

Модифицированные нуклеотиды - антидетерминанты аминоацилирования, препятствующие взаимодействию тРНК с чужой аминоацил-тРНК-синтетазой.

минимум одним. Специфическое взаимодействие между белком-ферментом и тРНК не укладывается

в понятие какого-либо кода, а представляет собой сложный набор взаимодействий, обеспечивающий структурную комплементарность двух макромолекул.

Искусственные суб-
страты, узнаваемые
аланил-тРНК-
синтетазой E. coli.
Основной элемент распознавания – неканоническая пара G-U в акцепторном стебле

в антикодоне (внизу), и в акцептирующем аминокислоту плече позволяют ферменту

АРСазе (голубая) опознать ее как правильную тРНК.

полипептидной цепи из аминокислот; это рибонуклеопротеид, построенный из двух субчастиц

диаметром около 30 нм.
функционально - молекулярная машина, протягивающая вдоль

себя цепь мРНК, считывающая закодированную в мРНК генетическую информацию и синтезирующая полипептидную цепь белка (рибозим).

Рибосома

Удлинение полипептидной цепи, катализируемое рибосомой

рибосомой, без участия какого-либо другого фермента.
Рибозимом является большая

субчастица рибосомы.

субчастиц
30S
50S

субчастицы.
Рибосомные субчастицы и рибосомные РНК E. coli

50 : 50

Дополнительные нуклеотиды эу-рРНК образуют множественные вставки, формирующие доп. домены, и не затрагивают основной структуры обеих рРНК

в полиакриламидном геле.
Каждый рибосомный белок имеет свою «персональную" посадочную
площадку на

рибосомной РНК.

премии по химии за 2009 год за трехмерную модель с

высоким разрешением малой субчастицы рибосомы E.coli, содержащей молекулу 16S-рРНК и рибосомные белки (Венкатраман Рамакришнан,Томас Стейц и Ада Йонат).

главный функциональный карман рибосомы.
рРНК определяют:
форму и морфологические

особенности субчастиц;
ассоциацию субчастиц;
связывание рибосомных белков;
организацию функциональных центров рибосом;
собственно катализ. 

связывания молекул РНК: один предназначен для мРНК, а три (названные

A-сайтом, P-сайтом и E-сайтом) — для молекул тРНК .

Малая субчастица в составе полной транслирующей рибосомы имеет два кодон-зависимых тРНК-связывающих участка:
аминоацил-тРНК-связывающий участок (А-сайт) и пептидил-тРНК-связывающий участок (Р-сайт).

Большая субчастица в составе полной транслирующей рибосомы имеет кодон-независимый тРНК-связывающий участок, специфичный для деацилированной тРНК (Е-сайт, от exit).

заняты только 2 участка
(Р и А или Р и

Е).
.

что и на предыдущем слайде (В).

функции:
Генетическую, или декодирующую – расшифровывает генетическую информацию ДНК, поступающую в

виде мРНК (принадлежит малой субчастице);
механическую – передвигает цепь мРНК (потриплетно) и молекулы тРНК (функцию «молекулярной машины» выполняет малая субчастица);
энзиматическую – катализирует реакцию транспептидации (функция рибозима принадлежит большой субчастице).

Две молекулы тРНК занимают А- и Р-сайты на малой субчастице.

Пептидилтрансферазный центр (РТС) расположен в борозде под центральным выступом большой субчастицы.
Факторы элонгации (EF) связываются в районе палочкообразного бокового выступа большой субчастицы.
Е-сайт для деацилированной тРНК находится на большой субчастице.

Е

al. (2000) Science 289:920-930
Белки (фиолет.) -
на периферии
23S РНК
(от белого
до

бежевого) –
ядро субчастицы

Уникально расположенный
А2451 23S рРНК осуществляет
кислотно-основной катализ. В

Атомное строение и рибозимная функция 50S-субчастицы Haloarcula marismortui

специфическом окружении его N3 может отнимать протон от амино-группы АК в А-сайте, повышая ее нуклеофильность. Этот протон затем пойдет в 3’-OH тРНК

EF1 (эукариоты) или EF-Tu (прокариоты).
Этап 2 – транспептидация.
Этап 3 –

транслокация при участии фактора элонгации EF2 или EF-G.
На этапах 1 и 3 участвует ГТФ, гидролизующаяся до ГДФ и ортофосфата.

Элементарный элонгационный цикл рибосомы

На этапе элонгации Р-сайт всегда занят остатком тРНК. Деацилированная тРНК из P-сайта перемещается в Е-сайт и затем покидает рибосому.

мРНК, обеспечива-ющее последователь-ное прочитывание цепи мРНК;
расплетание вторичной и третичной структуры

мРНК;
скорость у прокариот: 10-15 триплетов/сек;
скорость у эукариот: 1-10 триплетов/сек – замедление вслед-ствие регуляции трансляции.

Е

рибосомной субчастицы относительно ее “тела”;
подвижность палочкообразного бокового выступа большой

субчастицы.

Механическая подвижность рибосомы может обеспечивать преодоление энергетических барьеров:
при работе как “лентопротяжного механизма”;
при перенесении молекулы тРНК, связанной по нескольким точкам, из одного участка в другой в каждом элонгационном цикле.

Большая субчастица движется относительно мРНК, сдвигая деацилированную тРНК из P-участка

в Е-участок, а пептидил-тРНК из А в Р-участок на большой СЕ (но не на малой).
Этап 4: Малая СЕ перемещает мРНК на кодон

Аминоациладенилат – лабильное соединение со смешанной ангидридной связью между АК

и АМФ – стабилизируется в комплексе с аминоацил-тРНК-синтетазой.
Аминоацильный остаток переносится с аминоациладенилата в составе промежуточного фермент-субстратного комплекса на тРНК с образованием аминоацил-тРНК (сложноэфирная связь между АК и тРНК).

молекулу 16S-рРНК и рибосомные белки (В. Рамакришнан)
рРНК - бирюзовый,

зеленый и желтый;
Белки – красный и оранжевый

В. Рамакришнан (Кембридж),
Р. Стейц (Йель),
А. Йонат (Вайсмановский институт) - Нобелевская премия 2009 г

молекулу 23S-рРНК и рибосомные белки (Т. Стейц)