ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕКСОНА АДЕНОВИРУСА 3 ТИПА

Мукантаев Канатбек Найзабекович

крупного рогатого скота аденовирусной этиологии необходимо дифференцировать от вирусной диареи,

респираторно-синцитиального вируса, ринотрахеита и парагриппа-3. Для обнаружения вируса применяют различные методы, такие как выделение вируса, гибридизация in situ, иммуноферментный анализ, иммунофлюоресценция, рестрикционный анализ и ПЦР. Однако, вышеперечисленные методы затратные по времени и требуют дорогостоящего оборудования и системы культуры ткани. В связи с этим, получение рекомбинантных антигенов вируса имеющих диагностическое значение является весьма актуальным.

в Республике Казахстан, разработка современных экспресс тестов для выявления аденовирусной

инфекции, основанных на рекомбинантных антигенах вируса и моноклональных антителах является весьма актуальной для нашей страны.
В диагностическом плане наибольший интерес представляют такие протеины вируса как гексон, пентон и филаментозная структура. При этом гексон является группоспецифическим белком и индуцирует образование группоспецифических антител.

3-го типа.
Для достижения цели научной работы были поставлены следующие

задачи:
1. Дизайн генетической конструкции, несущей ген гексона бычьего аденовируса 3-го типа
2. Синтез гена гексона бычьего аденовируса и клонирование гена в экспрессионные плазмиды рЕТ32 и рЕТ28.
3. Трансформация компетентных клеток микроорганизмов полученными генетическими конструкциями.
4. Выделения и очистка рекомбинантного гексона бычьего аденовируса 3-го типа.
Новизна работы заключается в получении впервые в Казахстане рекомбинантного гексона бычьего аденовируса 3-го типа и разработке на его основе экспресс-теста для серологической диагностики болезней молодняка.
Теоретическая и практическая значимость. На основе полученных штаммов-продуцентов рекомбинантного гексона будут разработаны серологические экспресс-тесты для диагностики аденовирусных инфекций у крупного рогатого скота.

BL21(DE3), плазмидный вектор pGEM-TEasy (Promega, USA), pET28, pET32. Клетки E.

coli выращивали в LB среде.
Для синтеза гена гексона аденовируса крупного рогатого скота 3-го типа использованы олигонулеотиды синтезированные в условиях de novo.
Выделение и очистка плазмидной ДНК
Плазмидную ДНК выделяли из штамма E.coli DH5a методом щелочного лизиса. Очищали плазмидную ДНКметодом изопикнического центрифугирования.
Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
Разделение фрагментов ДНК проводили согласно Маниатису и др. методом электрофореза в горизонтальных агарозных гелях.

фрагментов ДНК проводили в агарозном геле. Фрагменты выделяли из геля

методом электроэлюции.
Лигирование фрагментов ДНК
Для лигирования фрагментов ДНК использовали ДНК-лигазу фага Т4. . Реакцию лигирования заканчивали после инкубирования в течение 45 минут при комнатной температуре.
Рестрикция ДНК
Гидролиз плазмидной ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI, XhoI и BamHI.
Трансформация клеток E.coli
Для трансформации клеток лабораторных штаммов E.coli DH5α и XLBlue использовали метод Ханахана.

Трансформация и экспрессия гетерологичного белка
Трансформацию компетентных клеток BL21 плазмидными векторами

рЕТ-28 и рЕТ-32 со вставками генов проводили методом электропорации. Трансформированные клетки были инкубированы в течение 1 часа при интенсивном встряхивании. Затем клетки высевали на агаризованную среду с антибиотиком в качестве селектирующего фактора и растили при +37°C в течение 16 часов.. Сбор клеток осуществляли центрифугированием в течение 7 минут.
Лизирование и хроматографическая очистка
Лизирование клеток осуществляли с использованием ультразвукового дезинтегратора. Очистку белка осуществляли металлохелатной хроматографией
Электрофорез
Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэммли в полиакриламидном геле.

на аппарате для вертикального электрофореза. Электрофоретический перенос антигенов из геля

на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с помощью прибора для иммуноблотинга. Для иммунохимического проявления специфических антигенов нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубировали в течение ночи при 4оС.
Затем отмывали по три раза и выдерживали в растворе моноклональных антител, После чего носитель вновь отмывали и инкубировали в рабочем разведении антивидовых антител, меченных пероксидазой.
Тандемная масс-спектрометрия (nanoLC-MS/MS)
????????????

конструкции, несущей ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса
В

результате проведенного дизайна, на основе pET28 и pET32 плазмид, были разработаны две генетические конструкции, несущих ген фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса крупного рогатого скота 3-го типа.
Экспрессионный регион плазмидного вектора pET28 вместе со встроенным геном включает гены 6His-Tag, тромбиновый сайт, ген фрагмента N-терминальной части гексона вируса и 6His-Tag. Прогнозируемая молекулярная масса рекомбинантного белка экспрессируемая плазмидой составляет 24 кДа.
В отличие от вектора pET28 экспрессионный регион плазмидного вектора pET32 включает гены тиоридоксинового белка, His-Tag, S-Tag, тромбина и энтерокиназы, His и S меток после выделения и очистки белка, гена фрагмента гексона и 6His-Tag.

несущей ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса 3-го типа
Рис.

1 - Схема генетической конструкции на основе pET28 плазмиды несущей ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса 3-го типа

ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса
На основе отобранной аминокислотной

последовательности фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса крупного рогатого скота получена нуклеотидная последовательность, оптимизированная для экспрессии в кишечной палочке.
К полученному гену фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса крупного рогатого скота со стороны 3’конца добавлена последовательность гексогистидиновой метки за которой следуют сайты для Xho и HindIII рестриктаз. Со стороны 5’-конца достроены сайты NcoI, EcorI и BamHI рестриктаз.
Синтез гена проводили методом двух раундовой полимеразной цепной реакцией. Молекулярная масса полученного продукта составляет 500 пар оснований, что соответствует прогнозируемой длине гена.

продукт первого раунда полимеразной цепной реакции; 2,3 – продукт второго

раунда полимеразной цепной реакции; 4 – молекулярные маркеры

гена фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса.
Полученный ген фрагмента N-терминальной части

гексона бычьего аденовируса 3-го типа по сайтам рестрикции BamHI и HindIII клонирован в экспрессионную плазмиду pET28. По сайтам рестрикции NcoI и XhoI полученный ген клонирован в экспрессионную плазмиду pET32.
Полученные конструкции трансформированы методом электропорации в экспрессионные штаммы E.coli BL21 и высевались на среду LB с содержанием антибиотика канамица для pET28 вектора и ампицилина для pET32 вектора.
Колонии клеток скринировались на наличие экспрессионных векторов, несущих ген фрагмента гексона бычьего аденовируса 3-го типа.
Результаты скрининга показали высокую эффективность трансформации. До 80% клонов несли плазмиды со вставками гена фрагмента гексона бычьего аденовируса 3-го типа.

1-7 – клона клеток штамма BL21/pET28/bAdv3 hexon; 8-14 – клона

клеток штамма BL21/pET32/bAdv3 hexon; 15 – положительный контроль; 16 – отрицательный контроль; 17 – молекулярные маркеры

После криоконсервации полученных штаммов микроорганизмов, определялась их экспрессионная активность.

активности штамм-продуцентов BL21/pET32/bAdv3 hexon (А) и BL21/pET28/bAdv3 hexon (Б): 1

– культура клеток без ИПТГ; 2 – 2 часа инкубирования с ИПТГ; 3 – 4 часов инкубирования с ИПТГ; 4 – 6 часов с ИПТГ; 5 – 12 часов с ИПТГ;
6 – молекулярные маркеры

Штамм-продуцент E.coli BL21/pET28/bAdv3hexon производил белок молекулярной массой 24 кДа. Штамм E.coli BL21/pET32/bAdv3hexon производил белок молекулярной массой 34 кДа.

очистки рекомбинантного гексона штаммы-продуценты культивировались в следующих условиях: концентрации индуктора

0,1 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ; температуры питательной среды 250С и 370С. При этом результаты эксперимента оценивались по относительному содержанию рекомбинантных белков в нерастворимой фракции лизатов штамма-продуцента.

Относительные количества рекомбинантных белков (%) в нерастворимых фракциях лизатов штаммов-продуцентов при различных условиях индукции экспрессии

Таблица 1

работы штаммов-продуцентов максимальная продукция рекомбинантных белков в растворимой фракции отмечена

при следующих условиях культивирования: концентрация индуктора 0,2 мМ, температура культивирования после индукции экспрессии 250С.
В следствии того, что рекомбинантный белок экспрессировался в тельца включения, важным параметром очистки является оптимальная концентрация мочевины в денатурирующем буфере. При определении оптимального денатурирующего буфера использовались различные концентрации мочевины. Из рисунка видно, что наиболее эффективным является 8 М мочевина.

–осадок после разрушения клеток; 2 – над осадочная жидкость после

разрушения клеток; 3 – 1М мочевина; 2 - 4М мочевина; 5 – 8М мочевина; 6 – 2 М мочевина; 7 – молекулярные маркеры

получены очищенные препараты антигенов. Для очистки рекомбинантных белков использовали металлхелатную

хроматографию на основе никель-сефарозы. В качестве эллюирующего буфера использовали буфер с содержанием различных концентраций имидазола. Электрофоретический анализ показал чистые препараты белка молекулярной массой 24 кДа

Рис.7 - ПААГ электрофорез белков после хроматографической очистки: 1-3 – 200 мМ имидазол; 4 – молекулярный маркер; 5-7 – 500 мМ имидазол