ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕКСОНА АДЕНОВИРУСА 3 ТИПА

Мукантаев Канатбек Найзабекович

обнаружения вируса применяют различные методы, такие как выделение вируса, гибридизация

in situ, иммуноферментный анализ, иммунофлюоресценция, рестрикционный анализ и ПЦР. Однако, вышеперечисленные методы затратные по времени и требуют дорогостоящего оборудования и системы культуры ткани. В связи с этим, получение рекомбинантных антигенов вируса имеющих диагностическое значение является весьма актуальным.

в Республике Казахстан, разработка современных экспресс тестов для выявления аденовирусной

инфекции, основанных на рекомбинантных антигенах вируса и моноклональных антителах является весьма актуальной для нашей страны.
В диагностическом плане наибольший интерес представляет капсидный белок аденовируса гексон. При этом гексон является группоспецифическим белком и индуцирует образование группоспецифических антител.

3-го типа.
Для достижения цели научной работы были поставлены следующие

задачи:
1. Дизайн генетической конструкции, несущей ген гексона бычьего аденовируса 3-го типа
2. Синтез гена гексона бычьего аденовируса и клонирование гена в экспрессионные плазмиды рЕТ32 и рЕТ28.
3. Трансформация компетентных клеток микроорганизмов полученными генетическими конструкциями.
4. Выделения и очистка рекомбинантного гексона бычьего аденовируса 3-го типа.
Новизна работы заключается в получении впервые в Казахстане рекомбинантного гексона бычьего аденовируса 3-го типа и разработке на его основе экспресс-теста для серологической диагностики болезней молодняка.
Теоретическая и практическая значимость. На основе полученных штаммов-продуцентов рекомбинантного гексона будут разработаны серологические экспресс-тесты для диагностики аденовирусных инфекций у крупного рогатого скота.

BL21(DE3), плазмидный вектор pGEM-TEasy (Promega, USA), pET28, pET32. Клетки E.

coli выращивали в LB среде.
Для синтеза гена гексона аденовируса крупного рогатого скота 3-го типа использованы олигонулеотиды синтезированные в условиях de novo.
Выделение и очистка плазмидной ДНК из штамма E.coli методом щелочного лизиса.
Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
Разделение фрагментов ДНК проводили в агарозном геле. Фрагменты выделяли из геля методом электроэлюции.
Лигирование фрагментов ДНК проводили с помощью фермента ДНК-лигазы фага Т4.
Рестрикцию плазмидной ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI, XhoI и BamHI.

клеток плазмидными векторами рЕТ-28 и рЕТ-32 со вставками генов и

экспрессия белка.
Лизирование клеток осуществляли с использованием ультразвукового дезинтегратора.
Очистку белка осуществляли металлохелатной хроматографией.
Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.
Постановка иммуноблотинга.
Тандемная масс-спектрометрия для качественной идентификация белка гексона и сравнения данных с базой данных SwissProt по программе Mascot.

конструкции, несущей ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса
В

результате проведенного дизайна, на основе pET28 и pET32 плазмид, были разработаны две генетические конструкции, несущих ген фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса крупного рогатого скота 3-го типа.
Экспрессионный регион плазмидного вектора pET28 вместе со встроенным геном включает гены 6His-Tag, тромбиновый сайт, ген фрагмента N-терминальной части гексона вируса и 6His-Tag. Прогнозируемая молекулярная масса рекомбинантного белка экспрессируемая плазмидой составляет 24 кДа.
В отличие от вектора pET28, экспрессионный регион плазмидного вектора pET32 включает гены тиоридоксинового белка, His-Tag, S-Tag, тромбина и энтерокиназы, His и S меток после выделения и очистки белка, гена фрагмента гексона и 6His-Tag.

несущей ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса 3-го типа
Рис.

1 - Схема генетической конструкции на основе pET28 плазмиды несущей ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса 3-го типа

ген фрагмента N-терминальной части гексона бычьего аденовируса
На основе отобранной аминокислотной

последовательности фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса крупного рогатого скота получена нуклеотидная последовательность, оптимизированная для экспрессии в кишечной палочке.
К полученному гену фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса крупного рогатого скота со стороны 3’конца добавлена последовательность гексогистидиновой метки за которой следуют сайты для Xho и HindIII рестриктаз. Со стороны 5’-конца достроены сайты NcoI, EcorI и BamHI рестриктаз.
Синтез гена проводили методом двух раундовой полимеразной цепной реакцией. Молекулярная масса полученного продукта составляет 500 пар оснований, что соответствует прогнозируемой длине гена.

продукт первого раунда полимеразной цепной реакции; 2,3 – продукт второго

раунда полимеразной цепной реакции; 4 – молекулярные маркеры

гена фрагмента N-терминальной части гексона аденовируса.
Полученный ген фрагмента N-терминальной части

гексона бычьего аденовируса 3-го типа по сайтам рестрикции BamHI и HindIII клонирован в экспрессионную плазмиду pET28. По сайтам рестрикции NcoI и XhoI полученный ген клонирован в экспрессионную плазмиду pET32.
Полученные конструкции трансформированы методом электропорации в экспрессионные штаммы E.coli BL21 и высевались на среду LB с содержанием антибиотика канамица для pET28 вектора и ампицилина для pET32 вектора.
Колонии клеток скринировались на наличие экспрессионных векторов, несущих ген фрагмента гексона бычьего аденовируса 3-го типа.
Результаты скрининга показали высокую эффективность трансформации. До 80% клонов несли плазмиды со вставками гена фрагмента гексона бычьего аденовируса 3-го типа.

1-7 – клона клеток штамма BL21/pET28/bAdv3 hexon; 8-14 – клона

клеток штамма BL21/pET32/bAdv3 hexon; 15 – положительный контроль; 16 – отрицательный контроль; 17 – молекулярные маркеры

После криоконсервации полученных штаммов микроорганизмов, определялась их экспрессионная активность.

активности штамм-продуцентов BL21/pET32/bAdv3 hexon (А) и BL21/pET28/bAdv3 hexon (Б): 1

– культура клеток без ИПТГ; 2 – 2 часа инкубирования с ИПТГ; 3 – 4 часов инкубирования с ИПТГ; 4 – 6 часов с ИПТГ; 5 – 12 часов с ИПТГ;
6 – молекулярные маркеры

Штамм E.coli BL21/pET32/bAdv3hexon производил белок молекулярной массой 34 кДа.
Штамм-продуцент E.coli BL21/pET28/bAdv3hexon производил белок молекулярной массой 24 кДа.

очистки рекомбинантного гексона штаммы-продуценты культивировались в следующих условиях: концентрации индуктора

0,1 мМ, 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ; температуры питательной среды 250С и 370С. При этом результаты эксперимента оценивались по относительному содержанию рекомбинантных белков в нерастворимой фракции лизатов штамма-продуцента.

Относительные количества рекомбинантных белков (%) в нерастворимых фракциях лизатов штаммов-продуцентов при различных условиях индукции экспрессии

Таблица 1

работы штаммов-продуцентов максимальная продукция рекомбинантных белков в растворимой фракции отмечена

при следующих условиях культивирования: концентрация индуктора 0,2 мМ, температура культивирования после индукции экспрессии 250С.
В следствии того, что рекомбинантный белок экспрессировался в тельца включения, важным параметром очистки является оптимальная концентрация мочевины в денатурирующем буфере. При определении оптимального денатурирующего буфера использовались различные концентрации мочевины. Из рисунка видно, что наиболее эффективным является 8 М мочевина.

–осадок после разрушения клеток; 2 – над осадочная жидкость после

разрушения клеток; 3 – 1М мочевина; 2 - 4М мочевина; 5 – 8М мочевина; 6 – 2 М мочевина; 7 – молекулярные маркеры

получены очищенные препараты антигенов. Для очистки рекомбинантных белков использовали металлхелатную

хроматографию на основе никель-сефарозы. В качестве эллюирующего буфера использовали буфер с содержанием различных концентраций имидазола. Электрофоретический анализ показал чистые препараты белка молекулярной массой 24 кДа

Рис.7 - ПААГ электрофорез белков после хроматографической очистки: 1-3 – 200 мМ имидазол; 4 – молекулярный маркер; 5-7 – 500 мМ имидазол

были представлены 43 наиболее вероятных белков, соответствующие полученным масс-спектрам, из

которых наибольший скор (Score 2033) соответствовал только одному гексоновому белку рода Mastadenovirus семейства Adenoviridae, что ещё раз подтверждает, что был получен именно гексон бычьего аденовируса.

на основе pET28 и pET32 плазмид, несущих ген фрагмента N-терминальной

части гексона аденовируса крупного рогатого скота 3-го типа.
2. Методом двух раундовой полимеразной цепной реакцией синтезирован ген с молекулярной массой 500 пар оснований, что соответствует прогнозируемой длине гена.
3. Проведена трансформация компетентных клеток экспрессионный штамм E.coli BL21 полученными генетическими конструкциями. Скрининг полученных колоний показал высокую эффективность трансформации составляющая 80%.
4. Выделен и очищен рекомбинантный гексон бычьего аденовируса 3 типа. Электрофоретический анализ показал чистые препараты белка молекулярной массой 24 и 34 кДа.